عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل الخلايا الموجبة Z المتساهلة من قوقعة فأر حديثي الولادة باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل عدد كبير من قوقعة الفئران أولا في إطار زمني قصير نسبيا للحفاظ على الخلايا قابلة للحياة والحصول على أنسجة أولية كافية. كخطوة ثانية ، يتم فصل الخلايا الإيجابية LAX Z ثم تصنيفها لإعداد الأنسجة للفرز.

ثم يتم فرز الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن بعد ذلك استخدام مجموعات LAX Z المنخفضة والمنخفضة الناتجة لمزيد من التجارب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الأذن ، مثل ما هي ملفات تعريف الجينات أو مجموعات خلايا معينة داخل الأذن الداخلية.

سيظهر الإجراء طالب طب طه جين أ من مختبرنا. أولا ، املأ أطباق بتري 35 ملم ب HBSS وضعها على كتلة ثلجية. ثم بعد استخدام مقص القزحية لقطع رأس 12 إلى 15 ، القتل الرحيم بعد الولادة ، محور عصبي يبلغ من العمر صفر إلى ثلاثة أيام ، واثنين من المراسلين المتساهلين والفئران البرية.

ضع الرؤوس على طبق بتري 60 ملم على كتلة ثلجية. بعد ذلك ، استخدم ملقط دومون رقم خمسة ومقص القزحية لاستئصال الفك السفلي واللسان من الرؤوس ، ثم قم بقص قاعدة الجمجمة على مستوى اللوحة. الآن قم بإزالة الجلد المغطى للعجل وقم بتمرير قاعدة الجمجمة عن طريق إدخال المقص في الجزء السفلي من الثقبة الماغنوم إلى منتصف الحنك.

قم بعمل شق آخر بالمقص من الحافة المقطوعة للحنك إلى الجانب العلوي من العجل على كلا الجانبين. الحرص على عدم إتلاف كبسولة الأذن. ثم أكمل عزل العظم الصدغي عن طريق عمل شقوق بزاوية 2 45 درجة ، بدءا من الجانب العلوي للإطار والماغنوم الممتد إلى القطع الإكليلي في الحنك الصلب.

ثم ضع العظام الصدغية المعزولة في أطباق بتري مقاس 35 ملم التي تحتوي على HBSS على كتلة الثلج وانقل كتلة الثلج إلى غطاء تشريح معقم. بعد ذلك ، املأ طبق بتري آخر مقاس 35 ملم هذه المرة ببرنامج تلفزيوني وضعه على كتلة الثلج. باستخدام ملقطين رقم 55.

ابدأ التشريح المجهري عن طريق إزالة القشرة وجذع الدماغ والمخيخ برفق من العظم الصدغي الذي يغطي الكبسولة الأذنية. ثم دون إزالة الكبسولة الأذنية، قم بتقطيع أجزاء من كبسولة القوقعة الصناعية بدءا من مدخل العصب القوقعي الدهليزي واستمر في الكبسولة الأذنية. بعد التعرض لقاعدة القوقعة ، اسحب برفق عضو الكورتي والأنسجة المحيطة.

ثم بدءا من القاعدة ، قم بإزالة أي عقدة حلزونية متبقية وخطوط ssis وانقل القوقعة إلى طبق بتري المملوء بماصة PBS الأولى. 50 ميكرولتر من PBS المعقم في وسط بئر إلى بئرين من طبق ثقافة ستة آبار غير مطلي. ثم لا تنقل أكثر من 20 محورا عصبيا ، اثنان من القوقعة المتساهلة في كل قطرة من PBS.

بعد ذلك ، قم بتسخين 50 ميكرولتر من 0.125٪ من التربسين لمدة دقيقتين تقريبا في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم أضف التربسين إلى القوقعة. الحرص على عدم هز الطبق.

احتضن القوقعة عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق. قم بإنهاء تحويل التربسين عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من مثبط تريبسين فول الصويا إلى كل قطرة ، ثم أضف 50 ميكرولترا إضافيا من الوسائط الكاملة بعد ضبط رجل ماصة P 200 على 125 ميكرولتر. استخدم طرف ماصة غير حاد سعة 300 ميكرولتر لتنظيف الخلايا برفق 80 مرة مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.

ثم بعد أن يتم تبريد كل قطرة ، أضف 200 ميكرولتر إضافي من الوسائط الكاملة لكل منها. حسنا ، مرر الخلايا الآن عبر مصفاة خلية 40 ميكرون إلى بئر جديد. داخل نفس لوحة الآبار الستة ثم نقل الخلايا من كل بئر إلى أنابيب الفاكس القياسية الفردية.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا البرية في كل أنبوب من الأنابيب الثلاثة ، متبوعا بالتخفيف ب 300 ميكرولتر من الوسائط الكاملة ل CUG فقط. يخفف التحكم 10 ميكرولتر من المحور العصبي ، خليتان LAX Z في 390 ميكرولتر من الوسائط الكاملة. انقل المحور العصبي المتبقي خليتين متساهلتين من Z إلى أنابيب فاكس في 400 ميكرولتر OTs.

ثم بعد احتضان الأنابيب في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، أضف 200 ميكرولتر من CUG المخفف إلى كل أنبوب فاكس مناسب. بعد ذلك ، لحماية جميع الأنابيب من الضوء ، واحتضان الخلايا في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. للتلوين أثناء احتضان الخلايا ، ضع 10 مل من أكوام الطازجة المحضرة بالإضافة إلى FBS في أنبوب سعة 15 مليلتر وضع الأنبوب على الجليد.

ثم أضف 1.8 مل من محلول كومة الثلج البارد إلى كل أنبوب من أنابيب الفاكس أسفل الغطاء المعقم مع إطفاء الأنوار لتقليل التعرض للضوء. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من الوسائط الكاملة.

اجمع جميع الحصص لعينة الفرز ، ثم أضف يوديد البروبيديوم إلى كل أنبوب مناسب إلى تركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل مليلتر. أخيرا ، بعد تغطية الخلايا ، ضعها مرة أخرى على الجليد. قم بإعداد بوابات الفرز عن طريق جمع 1000 حدث أولا لخلايا النوع البري غير الملوثة لتحديد توزيع الخلية على مخطط التشتت الأمامي مقابل الجانبي.

اضبط معلمات التشتت الأمامية والجانبية حسب الضرورة. ثم عوض بالنوع البري غير الملطخ من النوع البري PI والمحور العصبي الملون باللون CUG. خليتان LAX Z.

املأ أنبوبي فاكس ب 500 ميكرولتر من الوسائط الكاملة. ثم ابدأ التحليل باستخدام النوع البري PI الملون والمحور العصبي لبوابة الخلايا الملونة Lae CUG لاستبعاد الحطام بناء على مخطط مبعثر أمامي مقابل جانبي. استبعاد المضاعفات والكتل باستخدام ارتفاع التشتت الأمامي مقابل مخطط منطقة التشتت الأمامية.

ثم استبعاد الخلايا الميتة الإيجابية PI بناء على منطقة التشتت الأمامية مقابل مخطط منطقة PE sci الخمسة. لكل موضع مشية ، قم بإعداد مخطط لمنطقة التشتت الأمامية مقابل الشلال أو المنطقة الزرقاء في المحيط الهادئ. قم بتحليل 10،000 حدث من أنبوب عينة الفرز الذي يحتوي على محور عصبي اثنين من الخلايا الملونة PI و CUG المتساهلة باستخدام جميع البوابات التي تم تعيينها مع الخلايا البرية باستخدام مخططات من خلايا النوع البري.

قم بإنشاء بوابات للخلايا العالية الزرقاء المتتالية التي تقل عن 1٪ من إجمالي عدد الأحداث. يجب أن تحتوي الشلال Blue High Gates الآن على حوالي 15 إلى 20٪ من الخلايا في عينة Axon Two Lax. إن جعل هذه المحاور الخليتين المرتفعتين باستخدام مخطط تحليل الخلايا المتساهلة Axon يخلق الآن بوابة لأقل إنفلونزا ، 15 إلى 20٪ من الخلايا باستخدام استراتيجية البوابات المذكورة أعلاه.

قم بفرز الخلايا في أنابيب الفاكس التي تحتوي على وسائط كاملة ، مع الحفاظ على أنابيب التجميع في غرفة مبردة إلى أربع درجات مئوية أثناء الفرز. سجل عدد الخلايا التي تم حسابها بواسطة مقياس التدفق الخلوي لكل مجموعة سكانية في هذين الشكلين. مناطق التشتت الجانبية مقابل مناطق التشتت الأمامية من النوع البري المنفصل على اليسار والمحور العصبي اثنين LA Z على اليمين.

تظهر خلايا القوقعة الصناعية. لاحظ بوابات المجموعات المتميزة من الأحداث ذات الحجم الأكبر بكثير من تلك الأحداث الأقرب إلى المحور Y المصنفة على أنها السكان سالبين للحطام. عادة ما يتم استرداد 40 إلى 45٪ من الخلايا الخالية من الحطام من النوع البري ومحور قوقعة LAX Z في هاتين اللوحتين.

ويستعمل ارتفاع الانتثار الأمامي مقابل منطقة الانتثار الأمامي لاستبعاد الزوجات من الحطام المسور سابقا. يتم استبعاد الأحداث السكانية السلبية التي تنحرف عن الطبيعة الخطية المتوقعة للمؤامرة. ينتج عن هذا التحضير عادة 71.1٪ أحداث داخل البوابة المحددة. هنا.

يوديد البروبيديوم كما تم اكتشافه بواسطة قناة PE SCI الخمس لاستبعاد الخلايا الميتة كما لوحظ في هذه المخططات المبعثرة. حوالي 95٪ من الخلايا التي تم فرزها كانت قابلة للحياة ولم تتناول PI PI في هذه اللوحات. تم استخدام القناة الزرقاء المتتالية للكشف عن الركيزة الفلورية CUG كما هو موضح في الشكل الموجود على اليمين.

في المتوسط ، فإن أعلى 20٪ من الخلايا الإيجابية CUG هي خلايا عالية ترتبط بحوالي 15،000 محور عصبي ، خليتان مرتفعتان لكل 10 إلى 12. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وعزل الخلايا العالية المتساهلة باستخدام قياس التدفق الخلوي من أنسجة الأذن الداخلية لكل من تجارب تورينج الخلية والتجارب مثل التنميط الجيني.