عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا الليمفاوية عن المواقع الاستقرائية المعوية بما في ذلك بقع باير والغدد الليمفاوية المساريقية والمواقع المستجيبة بما في ذلك الصفيحة الخاصة والظهارة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة المخاطية مثل فهم الاستجابات المناعية لالتهابات الجهاز الهضمي والسرطانات والأمراض الالتهابية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تضمن عزل الخلايا الليمفاوية عالية النقاء والقابلة للحياة من الأجزاء المتميزة للأمعاء الدقيقة مع الحد الأدنى من التلوث عبر الجزءات.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه من الصعب تحديد وعزل الغدد الليمفاوية المساريق وبقع باير وتحقيق التوازن بين السرعة والدقة لتحقيق العوائد المثلى. لبدء البروتوكول ، ضع فأرا مخدرا مسبقا على ظهره ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم المقص لعمل شق في خط الوسط وفتح الجلد وجدار البطن لكشف التجويف البريتوني.

بعد ذلك ، حدد موقع الأعور واستخدم الملقط لسحب الأعور برفق. استخدم الملقط لتحريك الأمعاء الدقيقة بعناية إلى اليمين ، مما يكشف الغدد الليمفاوية المساريقية بأكملها أو سلسلة MLN التي تتماشى مع القولون. حدد العقدة السفلية في السلسلة الواقعة بالقرب من الأعور.

استخدم مجموعة واحدة من الملقط لاستيعاب دهون المساريق من حولها وحرك سلسلة MLN برفق من الأسفل إلى الأعلى عن طريق ملاقط الدهون حول العقدة الليمفاوية بمجموعة أخرى من الملقط. ثم بلل منشفة بوسائط الحصاد وضع سلسلة MLN على المنشفة الورقية. قم بإزالة دهون المساريق عن طريق لف السلسلة على المنشفة الورقية وسحب الدهون بمجموعتين من الملقط.

ضع MLN في وسائط الحصاد البارد لخطوات العزل اللاحقة. باستخدام المقص ، اقطع الأمعاء الدقيقة أسفل العضلة العاصرة البوابية وفوق الأعور. اسحب الأمعاء ببطء من الدقاق إلى الاثني عشر باستخدام مجموعة واحدة من الملقط أثناء إزالة دهون المساريق المرفقة باستخدام مجموعة أخرى من الملقط.

ضع الأمعاء على منشفة ورقية مبللة بوسائط الحصاد وقم بإزالة أي دهون مساريق متبقية بمجموعتين من الملقط. حافظ على ترطيب الأمعاء طوال هذه الخطوات عن طريق تطبيق وسائط الحصاد بشكل دوري. اجمع بقع باير عن طريق إزالتها من الأمعاء بمقص منحني.

اجمع 5-11 لصقة باير من الأمعاء الدقيقة. ضع بقع باير في وسائط الحصاد البارد لخطوات العزل اللاحقة. استخدم الجانب المسطح من الملقط وانزلق برفق من الاثني عشر باتجاه الدقاق لطرد محتوى البراز والمخاط.

كرر هذه الخطوة مرة واحدة لإزالة معظم المخاط. استخدم مقصا ناعما بنهاية حادة في نقطة واحدة ، وأدخل الطرف الحاد في الأمعاء واقطع الأمعاء مفتوحة طوليا من الاثني عشر إلى الدقاق. قطع الأمعاء المفتوحة بشكل جانبي إلى قطعتين سنتيمتريتران.

ضع القطع المعوية في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع وسائط حصاد بارد سعة 25 مل لخطوات العزل اللاحقة. اعزل الخلايا الليمفاوية عن MLN عن طريق فصلها برفق من خلال مصفاة خلوية 70 ميكرومتر باستخدام مكبس حقنة سعة ثلاثة ملليلتر. اغسل مصفاة الخلية بخمسة ملليلتر من وسائط الحصاد البارد.

قم بتكسير خلايا MLN عن طريق الطرد المركزي لها بقوة 400 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط حصاد بارد واحد مليلتر. اغسل قطع الأمعاء الدقيقة ثلاث مرات ب 25 مل من وسائط الحصاد البارد عن طريق قلب الأنبوب 10 مرات.

اسمح للقطع المعوية بالاستقرار وسكب المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 20 مل من محلول ثنائي إريثريتول أو DTE الدافئ مسبقا إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر الذي يحتوي على قطع الأمعاء وانقل المحتويات إلى قارورة إرلينماير المصنوعة من السيليكون سعة 50 مليلتر مع قضيب تحريك. استخدم مغناطيسا كبيرا على السطح الخارجي للقارورة لتثبيت قضيب التحريك ونقل الأنسجة والمحلول مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.

ثم قم بتدوير الأنبوب بأقصى إعداد لمدة 10 ثوان. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، مع الحرص على إبقاء قطع الأنسجة في الأنبوب الأصلي. بيليه الخلايا.

أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر وسائط الحصاد البارد وتخزينها على الثلج. أضف 20 مل من محلول DTE الدافئ مسبقا إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر الذي يحتوي على قطع الأمعاء وانقله مرة أخرى إلى قارورة Erlenmeyer المصنوعة من السيليكون سعة 50 مليلتر والتي تحتوي على قضيب تحريك. استخدم مغناطيسا كبيرا على السطح الخارجي للقارورة لتثبيت قضيب التحريك ونقل الأنسجة والمحلول مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.

دوامة الأنبوب بأقصى إعداد لمدة 10 ثوان. انقل المادة الطافية من خلال مصفاة خلوية 70 ميكرومتر إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا من المادة الطافية لأول علاج DTE وقم بالطرد المركزي للخلايا. أعد تعليق حبيبات الخلية في ثمانية ملليلتر من محلول 44٪ تدرج الكثافة أو DG في درجة حرارة الغرفة.

انقل محلول ثمانية مليلتر 44٪ DG وتعليق الخلية إلى أنبوب سفلي دائري من مادة البولي بروبيلين سعة 17 ملم × 100 ملم و 14 ملليلتر. ضع تحت الخلايا خمسة ملليلتر من محلول RT 67٪ DG. جهاز طرد مركزي عند 1 ، 600 مرة من الجاذبية لمدة 25 دقيقة عند RT دون استخدام الفرامل.

تشكل الخلايا القابلة للحياة طبقة مصفاة عند واجهة 44٪ و 67٪. قم بإزالة الطبقة الدهنية في الأعلى عن طريق الشفط بالتفريغ. استخدم ماصة باستور لحصاد الطبقة المصقولة في الواجهة ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 40 مل من وسائط الحصاد البارد.

خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 400 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط حصاد بارد واحد مليلتر. قم بإزالة الخلايا الظهارية من قطع الأنسجة المعوية عن طريق إضافة 25 مل من محلول EDTA الدافئ مسبقا إلى القطع المعوية المتبقية ونقل المحتويات إلى قارورة Erlenmeyer المصنوعة من السيليكون سعة 50 مل مع شريط التحريك والتقليب. أمسك قضيب التحريك وتخلص من المادة الطافية بعناية مع الاحتفاظ بالقطع المعوية في القارورة.

كرر خطوة إزالة الخلايا الظهارية مرة أخرى. بعد ذلك ، أضف 50 مل من وسائط الحصاد بدرجة حرارة الغرفة وحرك المحتويات لفترة وجيزة باستخدام مغناطيس. ثم دع القطع المعوية تستقر وتخلص بعناية من المادة الطافية

أضف 30 مل من محلول الكولاجيناز المسخن مسبقا وحرك القطع المعوية. بعد التحريك ، انقل الأنسجة المهضومة والمادة الطاففية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. افصل قطع الأنسجة المتبقية برفق باستخدام مكبس حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لهرسها من خلال الفلتر.

اغسل الفلتر ب 10 مل من وسائط الحصاد البارد وحبيبات الخلايا. بعد الغزل ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ثمانية ملليلتر من محلول درجة الحرارة المحيطة 44٪ DG. انقل ثمانية ملليلتر من معلق خلية محلول 44٪ DG إلى أنبوب سفلي دائري جديد 70 ملم × 100 ملليمتر.

قم بتسمية خمسة ملليلتر من محلول درجة الحرارة المحيطة 67٪ DG ثم الطرد المركزي بالتدرجات. قم بإزالة الطبقة الدهنية في الأعلى عن طريق الشفط بالتفريغ. استخدم ماصة باستور لحصاد الطبقة المصقولة في الواجهة ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 40 مل من وسائط الحصاد البارد.

أخيرا, أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من وسائط الحصاد البارد. تتميز كل حجرة مناعية معوية بتركيبة فريدة من مجموعات الخلايا الليمفاوية الفرعية. يتكون MLN في الغالب من خلايا ألفا بيتا التائية بينما الخلايا الليمفاوية PP هي في الغالب خلايا بائية.

يتكون تكوين الخلايا الليمفاوية LP بشكل أساسي من خلايا ألفا بيتا التائية والخلايا البائية. IEL هي بشكل أساسي خلايا جاما دلتا التائية وخلايا ألفا بيتا التائية التي لا تحتوي على خلايا بائية بشكل أساسي. عبرت خلايا ألفا بيتا التائية الإيجابية CD8 ألفا داخل مقصورات LP و IEL عن متجانس ألفا CD8 أو متجانس ألفا بيتا CD8 بينما عبرت خلايا ألفا بيتا التائية الإيجابية CD8 في الموقع الاستقرائي

عبرت غالبية خلايا جاما دلتا التائية في حجرة IEL عن CD8 alpha بينما تفتقر خلايا جاما دلتا التائية الموجودة في MLN إلى CD8 alpha. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر قضاء وقت كاف ورعاية أثناء خطوات عزل الأنسجة للحد من التلوث بين الأجزاء المعوية. بعد هذا الإجراء ، يمكن أن تخضع الخلايا الليمفاوية المعزولة لتحفيز خارج الجسم الحي ، وقياس التدفق الخلوي ، وتقنيات أخرى لمزيد من التحليل الظاهري والوظيفي.