على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تطوير طريقة عالية الكفاءة وعالية الإنتاجية لتوليد الخلايا المتغصنة أو DCs ، والتي تعكس بشكل مصيري تباعدها الظاهري والوظيفي في الجسم الحي. توجد الخلايا المتغصنة كمجموعات كبيرة في الأعضاء اللمفاوية. لذلك ، نستخدم ترابط المرشح لزيادة تواتر هذه الخلايا الأساسية في أنسجة المتبرع لتسهيل هذا العزلة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تزيل توليد جميع المجموعات الفرعية للتيار المستمر بأعداد مناسبة للتحليل باستخدام العوامل المتاحة تجاريا فقط. لحصاد ليجند flt-3 الذي يعبر عن خلايا الورم الميلانيني B16 من مزرعة ملتقية بنسبة 90٪ ، اغسل الخلايا أولا باستخدام PBS واحتضان المزرعة بنسبة 05٪ تريبسين عند 37 درجة مئوية. بعد 5 دقائق ، قم بإخماد نشاط البروتياز ب 20 مل من وسط ديما كامل 4 درجات مئوية وافصل طبقة نموذج الخلية الملتصقة باستخدام النقر الخفيف والماصة اللطيفة.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وعدادها. ثم, أعد تعليق تعليق الخلية واحدة إلى 1 مرات إلى 8 خلايا لكل تركيز مليلتر في PBS لحقنها تحت الجلد في C57 الأسود 6 الفئران المتلقية. عندما يصل قطر الورم إلى اثنين إلى عشرة ملليلتر ، احصد الطحال من الحاملة للورم وضع الطحال في طبق بتري يحتوي على وسط RPMI طازج.

باستخدام مشرط ، قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع مساحتها 0.2 سم مربع ، ثم احتضان الشظايا في عشرة ملليلتر من الكولاجيناز و Dnase عند 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة ، اسكب ملاط الأنسجة المهضوم جزئيا على مصفاة خلية 70 ميكرون ، واستخدم مكبس حقنة سعة خمسة ملليلتر للضغط على شظايا الأنسجة المتبقية من خلال شبكة المصفاة. اشطف الفلتر ب 10 مل من الوسط الطازج ، وقم بتجميع الغسيل مع بقية تعليق الخلية المفردة وحبيبات الخلايا.

نقوم بتعليق حبيبات الخلية في 2 مل من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من وسط RPMI الطازج ، وأعد تعليقها عند 1 مرات 10 إلى 8 خلايا لكل مليلتر في المخزن المؤقت لفرز الخلايا الذي يحتوي على كتلة FC. لعزل DCs خلوية البلازما ، امزج جيدا 300 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المسمى بالبيوتين من مجموعة عزل التيار المستمر للبلازما مع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المفردة الطحالية.

ضع الخلايا في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة ، مع النقر برفق كل ثلاث دقائق. ثم اغسل الخلايا ب 12 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من عازلة الفرز الطازجة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا في 300 ميكرولتر من الخرز المترافق مع الأجسام المضادة المضادة للبيوتين لمدة 15 دقيقة أخرى في الماء المثلج مع النقر المنتظم.

بعد غسل الخلايا في مخزن مؤقت للفرز الطازج ، أعد تعليق البليت في 2 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا ، وقم بتحميل عمود مغناطيسي بحجم مناسب على المغناطيس المقابل له. قم بموازنة العمود بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا الطازجة 4 درجات مئوية. عندما يتم تصريف كل المخزن المؤقت من أعلى العمود ، أضف الخلايا بعناية إلى مركز سطح رأس العمود ، واجمع التدفق.

ثم اغسل العمود ب 10 ملليلتر من مخزن الفرز الطازج 4 درجات مئوية واجمع التدفق في نفس الأنبوب. بعد المرور على الرغم من عمود مغناطيسي ثان ، يمكن توقع وجود خلايا شجيرية خلوية في البلازما بنقاء أكبر من 94٪. لعزل CD8aplha + و CD8alpha-DCs ، امزج باقي تعليق خلايا الطحال مع 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المترافقة بيوتيشن من مجموعة عزل الخلايا المتغصنة CD8alpha + لمدة 15 دقيقة على الجليد مع النقر اللطيف ، كما هو موضح للتو.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في 12 مل من 4 درجات مئوية لفرز الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا الطازجة 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، امزج الخلايا مع 100 ميكرولتر من حبات CD8alpha + مجموعة عزل الخلايا المتغصنة المضادة للبيوتين. بعد 15 دقيقة على الجليد مع النقر اللطيف ، اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من 4 درجات مئوية لفرز الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من المخزن المؤقت للفرز الطازج 4 درجات مئوية.

في نهاية الحضانة ، قم بفرز الخلايا عن طريق فصل الخرزة المغناطيسية ، كما هو موضح للتو ، وجمع التدفق والغسيل الأول. ثم, قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لفرز الخلايا الطازجة 4 درجات مئوية. الآن قم بتسمية الخلايا ب 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق المضاد ل CD8aplha من المجموعة ، وقم بتمرير الخلايا عبر عمود جديد ، وجمع تدفق الخلايا التغصنية CD8alpha.

لجمع CD8alpha + DCs ، انقل العمود إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، واغمر 5 ملليلتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا الطازجة 4 درجات مئوية عبر العمود. بعد تشغيل الخلايا من خلال عمود ثان ، يمكن توقع وجود أكبر من 96٪ CD8alpha + خلايا شجيرية. لعزل خلايا CD8alpha ، قم بتدوير معلق الخلية CD8alpha-flow-through.

ثم قم بتسمية الخلايا ب 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضاد ل CD11 واجمع مجموعة الخلايا الإيجابية للحبة المغناطيسية ، كما هو موضح للتو ، للحصول على مجموعة فرعية أكبر من 97٪ من الخلايا التغصنية CD8alpha. أخيرا ، حدد عدد الخلايا الحية ، عن طريق استبعاد trypan blue. بمجرد أن يصبح الورم واضحا ، تظهر الفئران الحاملة لورم الترابط B16 flt-3 باستمرار زيادة كبيرة في الخلايا الطحالية التي ترتبط بتوسع المجموعات الفرعية للخلايا المتغصنة الطحالية.

ومن المثير للاهتمام ، أنه في حين لوحظت زيادة بمقدار 15 إلى 20 ضعفا في أعداد الخلايا المطلقة للتيار المستمر التقليدية في هذه ، لوحظت زيادة بمقدار 4 أضعاف فقط للمجموعة الفرعية من التيار المستمر الخلوي في البلازما. تتميز المجموعات الفرعية المختلفة للخلايا المتغصنة وفقا لتعبير B220 و CD11b و CD11c و CD8alpha. تظهر مجموعات الخلايا أيضا علامات مجموعة فرعية فريدة أخرى ، ومع ذلك ، مع mPDCA1 يتم التعبير عنها حصريا على خلوي البلازما DCs DEC205 التي يتم التعبير عنها بشكل كبير على CD8alpa + DCs ، و CD11b و 33D1 التي تم اكتشافها بشكل بارز على CD8alpha-DCs.

باستخدام هذه الطريقة ، أثبتنا أن CD8alpa + DCs هي الأكثر كفاءة في تقديم المستضدات بواسطة جزيئات رابطة القرص المضغوط إلى مجموعة متخصصة من الخلايا التائية تعرف باسم خلايا NKT الثابتة. الميزة الأكثر أهمية لعزل التيار المستمر هي الحفاظ على العقم الصارم والظروف الخالية من مضادات التزهر. أثناء الإجراءات ، تستجيب هذه الخلايا التائية بشكل كبير لمضادات التروكسين.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع الخلايا برفق ، لأن التحفيز الميكانيكي المتكرر قد يغير حالة نضج الخلايا الصغيرة. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لعزل عدد كبير من جميع المجموعات الفرعية الرئيسية للتيار المستمر من الطحال الفردي. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.