نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس في الجسم الحي Electroporation

انتقلت جين إلى الأذن الداخلية للفأر النامية عن طريق في الجسم الحي ، التثقيب الكهربائي لينغ وانغ ، هان جانغ ، وجون بورغاندي ، مركز أوريغون لأبحاث السمع ، جامعة أوريغون للصحة والعلوم. اسمي جون بورغاندي. مختبري في مركز أبحاث السمع في ولاية أوريغون في جامعة أوريغون للصحة والعلوم.

اسمي أنغ. أنا ملصق في مختبر جونز. أنا أنج أيضا في مختبر جونز كمساعد باحث.

ينقسم عرضنا إلى أربعة أجزاء. الأول هو شق البطن البطني. نوضح قلم الصوديوم ، التخدير القائم على الباربيتال ، كيفية اختبار كفاية التخدير ، حماية القرنية ، إعداد موقع الجراحة ، تطهير ورقة بيانات جراحة بقاء الفأر ، شق خط الوسط البطني للجناح الجراحي عبر الجلد وجدار البطن وإخراج قرون الرحم.

الجزء الثاني هو الحقن المجهري عبر الرحم. نظهر الإضاءة العابرة للجنين ، والجنين ، وإعادة التوجيه ، والحقن المجهري ، والماصة ، والتصنيع ، والحقن المجهري في Otis في اليوم الجنيني 11.5 واليوم الجنيني 12.5. الجزء الثالث في الجسم الحي.

نظهر وضع القطب الكهربائي على غرار المجداف ، والتثقيب الكهربائي لليوم الجنيني 11.5 مساعدة الماوس. الجزء الرابع هو النتائج التمثيلية. نعرض التعبير عن GFP في القوقعة الجنينية المتأخرة والمبكرة بعد الولادة.

نتج ذلك عن التثقيب الكهربائي في الجسم الحي من Otis مع التعبير البلازميد في اليوم الجنيني 11.5 الجزء الأول من شق البطن البطني. يتم تثبيت السد بإحكام عن طريق الإمساك بالجلد خلف الرقبة والذيل والطرف الخلفي الأيسر. يتم إعطاء حقن داخل الصفاق من مخدر بنتوباربيتال الصوديوم بعد مسح البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.

يتم وضع الفأر داخل قفص منزله لمدة أربع إلى خمس دقائق للسماح للمخدر بالعمل. تستخدم قرصات القدم والذيل لتقييم مدى كفاية التخدير. يغلق هذا السد استجابة لقرصة الذيل ويحتاج إلى دقيقتين أخريين قبل أن يصبح غير مستجيب للمنبهات الضارة.

يتم وضع مرهم العيون المعقم على العينين لحماية القرنيات من الجفاف. نقوم بإعداد موقع الجراحة في غطاء دخان كيميائي لتقليل انتشار الفراء والوبر. يتم حلق الفراء بشفرة رفيعة لفضح الجلد الذي يغطي جدار البطن.

تسهل إزالة الفراء الكاملة التئام الشق بعد الجراحة. يتم تطهير جلد البطن عن طريق تمريرات متناوبة من 70٪ إيثانول بيتادين و 70٪ إيثانول. اسحب دائما من المنقاري إلى التدليل واستخدم كرة قطنية جراحية جديدة أو قضيب قطني برأس.

لكل تمريرة ، نقوم بتقييم عمق وجودة التنفس أثناء التطهير للتأكد من أن السد لا يستجيب بعد ، بعد تمريرة الإيثانول الثانية بنسبة 70٪ ، وضعنا على الفور السطح البطني اللعين لأسفل على ستارة معقمة ووضعناها على وسادة ساخنة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لتدفئتها. هذا هو الوقت المناسب لتسجيل بيانات ما قبل الجراحة في ورقة سجل جراحة البقاء على قيد الحياة بالماوس. لدينا ورقة بيانات جراحة بقاء الفئران الملحقة كمعلومات تكميلية.

ضع في اعتبارك تضمين ورقة البيانات وبروتوكول رعاية الخاص بك حتى تتمكن لجنة رعاية واستخدامها المؤسسية من معرفة كيفية مراقبة بيانات ما قبل الجراحة وبعدها. نكمل ورقة سجل واحدة لكل موضوع جراحي. نحن نفضل إجراء الجراحة في بيئة معقمة ، على الرغم من أن هذا ليس مطلوبا عادة للقوارض.

سطح العمل منفصل عن محرك المنفاخ والمبيت الكامل ، لذلك لا ينتقل أي اهتزاز إلى المستخدم. أثناء الحقن المجهري ، قمنا بإلحاق معلومات تكميلية ، وهو رسم تخطيطي للتعديلات التي أجريناها على غطاء التدفق الصفحي لتسهيل نقل الجينات في الرحم ، والتغييرات الأساسية هي تحدي المنخفض وقواطع إضاءة المسار وأوعية مخفية لأسلاك طاقة الأجهزة ، ومسار توجيه للدوائر الكهربائية الملحقة. يتكون الجناح الجراحي من الحقيبة الرابعة الكهربائية المرهبة ، والحمام الدافئ ، ومناور XY ، و Z ، والفلورة الاستريو ، والمجهر التشريحي ، ومصدر ضوء الألياف البصرية ، والأدوات الجراحية.

تستخدم دواسات القدم لتشغيل الحاقن الصغير ، ويدخل التركيز. يتم تعقيم الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف. يجب إعادة تعقيم الأدوات بين الفئران باستخدام معقم الخرز الزجاجي أو عن طريق إعادة تعقيم سائق الإبرة.

ملقط حلقة مقص بالي والملقط الوعائي من الأدوات الأساسية. شق خط الوسط البطني ، أمسك الجلد بالملقط الوعائي واستئصال التكامل باستخدام مقص الكرة ، وقم بتمديد الشق من 10 إلى 14 ملم. حدد الشريط اللاوعائي الأبيض للأنسجة المتصلة المسمى الخط الربا، وخط الوسط البطني للبطن يشق الألبا الخطي باستخدام المقص الكروي المائل

الحرص على عدم تقطيع الأمعاء أو ضمادات الدهون الأربية. قم بري البطن على الفور بمحلول رنين مرضع معقم Prewarm. تقييم مواقع الشق في الجلد وجدار البطن بحثا عن النزيف.

الضغط المباشر باستخدام ملقط حاد سيوقف النزيف الطفيف في حالة وجوده ، وإخراج قرون الرحم اليمنى واليسرى باستخدام ملقط مائل حلقي. أمسك قرن الرحم الأيمن برفق بأحد طرفي الملقط واسحب الرحم نحو شق خط الوسط. استخدم يدك الحرة لمعالجة الجانب الجانبي للسد برفق لتسهيل ربط الرحم.

لا يتم استخدام الملقط أبدا لضغط الرحم وسحبه للخارج. نظرا لأن هذا يمكن أن يتلف الأوعية الدموية الرحمية أو الأجنة ، كرر إجراء الإخراج للقرن الرحمي الأيسر. قم على الفور بري قرون الرحم الخارجية حديثا بمحلول رنين مرحب بالتسخين ، وأعد إدخال ضمادات الدهون الداخلية أو الأمعاء برفق في حالة خروجها مع الرحم.

هذا لا يواجه كثيرا. الجزء الثاني الحقن المجهري للرحم. يتم ترتيب السد تحت هدف مسافة العمل الطويلة ويتم ضبط ضوء الألياف البصرية للكابل الناعم على جدار الرحم.

يتم الضغط على الرحم برفق بإصبع اليد الحرة. لتسهيل تحديد اتجاه الجنين. يجب أن يكون الضوء المنبعث من كابل الألياف الضوئية بأقل شدة مطلوبة لتقييم اتجاه الجنين بدقة.

يمكن للضوء الشديد أن ينقل الحرارة إلى الرحم مما قد يسبب مضاعفات. نحمل ضوء الألياف البصرية والرحم بيد واحدة ونستخدم إصبعا على أيدينا الحرة لإعادة وضع الجنين عن طريق الجس اللطيف. نوضح في ما يلي ثلاثة مقاطع فيديو عن طريق المجهر EC واتجاهات الجنين الشائعة التي يلاحظها الرحم.

سيرى المشاهد المنظر المجهري الذي نراه أثناء الإضاءة العابرة ، على الرغم من أن الإضاءة العابرة للرحم بالأبيض والأسود تسمح باكتشاف اتجاه الجنين في الجسم الحي. في هذا المثال ، يكون الجنين في وضع الوقوف على الرأس مع مواجهة سطحه البطني للمشاهد. من خلال تبديل الرحم ذهابا وإيابا ، يمكننا اكتشاف الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى والذيل ورأس العين اليسرى.

في هذا المثال ، يكون الجنين مرة أخرى في وضع الوقوف على الرأس ، لكنه يدور حوالي 90 درجة فيما يتعلق بالمحور الخلفي الأمامي. من خلال تبديل الرحم برفق ذهابا وإيابا ، يمكننا رؤية أشكال المجداف التي تحدد الطرف الخلفي الأيسر والطرف الأيسر. الدماغ الخلفي واضح أيضا.

الجنين في وضع مستقيم مع جانبه الأيسر في مواجهة المشاهد. يمكن اكتشاف البطين الرابع الناشئ على أنه رقعة ساطعة في الدماغ الخلفي. كما تظهر الرأس في العين اليسرى والطرف الأربعة الأيسر والأطراف الخلفية اليسرى.

اللطيف على الرحم يعيد توجيه الأجنة قليلا لتمكين الكشف عن الجذع الرئيسي للوريد الرئيسي للرأس وفروعه الأمامية والخلفية ، والتي تتميز بعلامة النجمة البيضاء والسوداء على التوالي. كما سنرى ، يقع Otis في منتصف الطريق بين الفرعين الأمامي والخلفي لوريد الرأس الأساسي. لا يمكن رؤية Otis نفسه من خلال الرحم عن طريق transillumination.

نوضح في مقطعين متتاليين من الفحص المجهري بالفيديو كيفية إعادة توجيه الجنين للحقن المجهري في مساعدة Otis. الهدف هو تحديد المعالم الجنينية التي تسمح باستيفاء موقع الأذن في الرأس الجانبي. Mesen con ، هدفنا هو إعادة توجيه الجنين من الوضع الظهري إلى الوضع الجانبي حتى نتمكن من تحديد وريد الرأس الأساسي.

يتضح البطين الرابع للدماغ المتوسط واليسار للطرف في الوضع الظهري. يؤدي الضغط اللطيف على الرحم إلى تحويل اتجاه الجنين من الظهرية إلى اللاحقة. رأس العين اليسرى ، الدماغ المتوسط ، والبطين الرابع واضحة بسهولة.

أن وريد الرأس الأساسي وفرعه الخلفي المشار إليه بعلامة النجمة واضحان أيضا. لم يتم الكشف عن الفرع الأمامي من وريد الرأس الأساسي بوضوح. هدفنا ، مرة أخرى ، هو توجيه الجنين حتى يتمكن من تحديد وريد الرأس الأساسي ، ولكن تحت تكبير أعلى مناسب للحقن المجهري للرحم.

الشريط النخلي للأوعية الرحمية والعين اليسرى في هذا المنظور الجانبي. يؤدي الضغط اللطيف على الرحم إلى تغيير موضع الجنين ، حتى نتمكن من اكتشاف العين اليسرى للبطين الرابع. يصنع وريد الرأس الأساسي وفرعه الخلفي المميز بعلامة النجمة والوريد الرئيسي الرئيسي وفروعه شكل قوائم كرة القدم الأمريكية.

لا يمكن رؤية الحويصلة الأذنية من خلال الرحم ، لكنها تقع في وسط القوائم. بدأت لين تسلسل حقن لجنين واحد. إنها تضيء الرحم ، وتعيد توجيه الجنين لحقن دقيق ، وتجلب ماصة الحقن الدقيقة المملوءة باللون الأخضر السريع إلى الحقل.

يتم توصيل ماصة الحقن الدقيقة بحامل ماصة يتم تثبيته بواسطة مناور ميكروم X ، Y ، z. يتم توصيل الحامل المغناطيسي للمناور بلوحة فولاذية بقاعدة تفلون تسمح بتحديد المواقع الإجمالية لماصة الحقن المجهري بسهولة. الإبرة متقدمة باستخدام مقبض التحكم بالميكرومتر الأمامي على المناور بشكل مناسب.

الماصات المصنعة ضرورية للحقن المجهري المؤلم في جنين الفأر في مرحلة أوتيس المبكرة. نقوم بسحب أنابيب شعرية زجاجية سميكة الجدران باستخدام مجتذب ماصة أفقي. يتم كسر الماصة الناتجة الموضحة في A يدويا باستخدام ملقط عند موضع القطر الخارجي من 14 إلى 16 ميكرون تقريبا المشار إليه بواسطة رأس السهم في B.

نقوم بشطبة الماصة عند حوالي 20 درجة لشحذ طرف الماصة كما هو موضح في اللوحة D يتم توفير معلمات سحب ماصات الحقن الدقيق وشطفها في النص المصاحب. نوضح في مقطعي الفحص المجهري التاليين الحقن المجهري في مساعدة الأذن في الفأر في الأيام الجنينية 11.5 و 12.5. هدفنا هو إثبات الحقن المجهري للرحم في اليوم الجنيني ، 11.5 الأذن من الفأر.

أولا ، نقوم بحقن الأذن بدون وجود الرحم لإظهار كيفية ظهور الحقن المستهدف بشكل صحيح بشكل لا لبس فيه. ثم نظهر حقنة دقيقة أصلية عبر الرحم. في هذا الحقن الأول ، تم شق الرحم للسماح للكيس الحشوي ببثق الشريط المتساقط الذي يغطي كيس الصفار الحشوي.

تظل المشيمة ملتصقة بالرحم والجنين على قيد الحياة. مع إزالة الرحم من الناحية الجسدية ، نرى البطين الرابع ، وريد الرأس الأساسي ، وفروعه الأمامية والخلفية ، والماصة والموقع التقريبي للكيس باللون الأبيض. في بداية تسلسل الحقن هذا ، يتم الكشف عن تدفق الدم في الأوعية الدموية في كيس صفار البيض الحشوي.

يتم تطوير الماصة من خلال كيس صفار البيض الحشوي ويتم حقن داي في ملاحظة المرض ، والقناة اللمفاوية الداخلية ظهريا وموضع الأذن في وسط القوائم. الأذن في منتصف الطريق بين الفرعين الأمامي والخلفي لوريد الرأس الأساسي, حقن الرحم المجهري في اليوم الجنيني. 11.5 تتطلب الأذن الفأرية الكشف عن وريد الرأس الأساسي وفرع واحد على الأقل من فروعه لتقدير موقع مساعدة الأذن.

هدفنا في هذا المثال التخطيطي ، يتم الكشف عن كل من الفروع الأمامية والخلفية لوريد الرأس الأساسي مع تمييز منطقة OUC باللون الأبيض. العرض الأكثر واقعية للجنين هو الذي يتم فيه اكتشاف الجذع الرئيسي لوريد الرأس الأساسي جنبا إلى جنب مع فرع واحد فقط من فروعه والمثال الموضح فقط الفرع الخلفي من وريد الرأس الأساسي ، ولكن هذا يكفي لتفسير موقع الأذن. يتم تطوير PT من خلال الرحم ويتم حقن الصبغة في الأذن.

ننتظر 30 ثانية للسماح للصبغة بالخروج من التجويف الأمنيوسي ، وعند هذه النقطة يمكننا رؤية القناة اللمفاوية الداخلية ظهريا والدهليز. نختتم بعرض تكبير منخفض للجنين الذي حقننا كيسه للتو لتوفير منظور تشريحي في هذا الرأي ، يتم رؤية البطين الرابع للعين اليسرى والأوعية الدموية الرحمية. نظهر التحويل والحقن المجهري في اليوم الجنيني 12 كيس الأذن الفأر والحقن المجهري في البطين الرابع الناشئ من الدماغ الخلفي.

تسمح لنا Transillumination باكتشاف وريد الرأس الأساسي في هذا المنظر الجانبي الأيسر وكذلك العين. يتم نقل الماصة عبر الرحم إلى الحويصلة الأذنية وتموت بالحقن لملء تجويفها. لحقن البطين الرابع ، نقوم بتدوير الجنين 90 درجة للحصول على رؤية ظهرية للدماغ الخلفي.

الكيس الأيسر المحقون الآن على الجانب الأيسر. يتم تقدم الماصة عبر الرحم والأخضر السريع ممزوج باللور. يتم حقن ديكستران مترافق في البطين الرابع.

لاحظ أن حجم الصبغة المحقونة لا يدخل الدماغ المتوسط في الجسم الحي. يتم تقييم التألق بعد الحقن للتحقق من صحة توطين ديكستران في البطين الرابع. ثم يتم إعادة توجيه الجنين من الوضع الظهري إلى الوضع الجانبي.

القناة اللمفاوية الداخلية هي مجرد بطنية للبطين الرابع في هذا المنظر الجانبي. في الجسم الحي يضان يتحقق من توطين ديكستران في البطين الرابع. عند الولادة ، نقوم بفحص الجراء بحثا عن التألق الأخضر في البطين الرابع باستخدام مضان epi.

الجراء المجهرية التشريحية ذات التألق الأخضر في أدمغتها الخلفية أذنا داخلية تم التلاعب بها أثناء التطور الجنيني الجزء الثالث في الجسم الحي. بعد ملء الكيس ببلازميد التعبير ، يتم ري الرحم حديثا بمحلول رنين مرضع دافئ. يسهل Transillumination توسيط كيس ODU في مجال القطب.

يتم سحب الرأس المعدني لضوء الألياف الضوئية من سطح الرحم. قبل البدء في قطار نبض الموجة المربعة ، نوضح في مقطع الفحص المجهري التالي دورة التثقيب الكهربائي الكاملة في الجسم الحي. يتطلب التثقيب الكهربائي لليوم الجنيني ، 11.5 كيس أذني للفأر وضعا لطيفا لأقطاب نمط المجداف على الرحم.

في هذا المثال ، تم ملء الكيس الأذني الأيسر ببلازميد التعبير وتم ري الرحم حديثا باستخدام جرنات مرضعة. يتم وضع الكاثود بشكل جانبي فيما يتعلق بكيس الأذن المملوء ويتم وضع القصيدة وسطيا في بداية تسلسل التشكيل ، ويتركز الكيس الأذني في حقل المجداف. يتم ضغط الرحم برفق ويتم بدء قطار نبض الموجة المربعة بمفتاح دواسة القدم.

من الناحية المثالية ، يتم توصيل 60 إلى مائة مللي أمبير من التيار لكل نبضة. ثم يتم تحرير الرحم وريه على الفور. يتم إرجاع الرحم المروي حديثا إلى تجويف البطن عن طريق الضغط اللطيف باستخدام ملقط الحلقة.

بمجرد استيعاب الرحم ، يتم شطف تجويف البطن بحوالي أربعة ميل من الرنين المرضعات ، مما يترك حوالي ميل واحد من الرنين المرضع في تجويف البطن للمساعدة في الحفاظ على ترطيب السد الذي سيشرب كمية أقل من الماء من المعتاد مباشرة بعد جراحة البطن. يتم إغلاق جدار البطن ثم الجلد بخياطة قابلة للامتصاص باستخدام محرك إبرة. يحتوي سائق الإبرة الخاص بنا على مقص مدمج يبسط الإغلاق.

نحن نفضل غرزة جارية لكل من جدار البطن والجلد. نقوم بقفل كل غرزة أخرى لتوفير دعم إضافي في موقع الشق. نقوم بإعطاء دواء مضاد للالتهابات غير الستيرويدي تحت الجلد قبل وضع السد في قفص الاسترداد.

استشر طاقمك البيطري فيما يتعلق بالمسكنات الوقائية التي تفضلها لجنة رعاية واستخدامها المؤسسية. يقع السد في ستارة معقمة ويوضع على أرضية قفص الاسترداد الساخن. يحتوي قفص الاسترداد على مادة تعشيش ، وأنبوب أحمر للغطاء ، وطعام مختبر ، وزجاجة ماء.

يتم إعادة تجميع القفص بغطاء محرك مرشح في الأعلى في صباح اليوم التالي للجراحة. السد مهيأ بشكل جميل ، متنقل ، وقادر على التوازن على أطرافها الخلفية للاستفسار عن الجزء العلوي من القفص المفتوح. خط الخياطة في البطن نظيف وجاف ولا يظهر أي دليل على الانفصال أو الاحمرار أو التورم.

لقد ألحقنا وثيقة تناقش تطوير بروتوكول رعاية لنقل الجينات في الرحم. تحتوي الوثيقة على لغة قد تكون مفيدة أثناء تصميم بروتوكول خاص بالمؤسسة بالتشاور مع لجنة رعاية واستخدامها. الجزء الرابع، النتائج التمثيلية.

تظهر لوحتا النتائج التمثيلية A و B قوقعة ممثلة من جرو ما بعد الولادة السادس تم حقن Otis ببلازميد تعبير بروتين فلوري أخضر محسن في اليوم الجنيني 11.5 ثم الكهربائي. تمت إزالة الجدار الجانبي للقوقعة من منتصف المدة والقمة. يوجد تعبير GFP فقط من القاعدة إلى منتصف فترة القوقعة ويتبع توزيع علامة خلية الشعر الميوسين سبعة أ الموضح في اللوحة B.تظهر اللوحة C إسقاطا متحد البؤر منخفض التكبير لليوم الجنيني.

18.5 عضو فأر من مناعة كورد ملطخة بالميوسين يتم توزيع الخلايا المنقولة بالجسم المضاد سبعة أ في جميع أنحاء عضو الكورد. تظهر اللوحة D إسقاطا متحد البؤر عالي التكبير لليوم الجنيني. 18.5 عضو الفأر من الكورد ملطخ ب CYN. سبعة.

يتم الكشف عن تعبير GFP في خلايا الشعر الداخلية والخارجية والخلايا بين الكتائب والخلايا العمودية وخلايا TER. نقل الجينات بوساطة التثقيب الكهربائي إلى Otis في اليوم الجنيني 11.5 أسلاف Transfect التي تؤدي إلى ظهور جميع أنواع الخلايا المكونة داخل عضو الكورد.