علم الوراثة العكسية الاسترداد بوساطة من نوروفيروس الفئران المعدية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استعادة الفيروس العصبي المعدي للعين باستخدام نظامين وراثيين عكسيين. مرحبا ، أنا أرماندو أرياس من قسم علم الفيروسات في إمبريال كوليدج في لندن. في مجموعتنا ، نحن مهتمون بتشريح الآليات الجزيئية في ظل تكاثر الفيروس العصبي الأساسي.

نوروفيروسات هي سبب رئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء. لا تزال التقنيات الجزيئية النفاثة في جميع أنحاء العالم لتوصيفها جديدة نسبيا. كان تحديد الأساليب المضادة للفيروسات الجديدة والرؤى حول دورة حياة الفيروس العصبي محدودا بسبب عدم قدرتها على إكمال عدوى منتجة في زراعة الخلايا.

فتحت العزل الأخير لمضادات الفيروسات القادرة على إصابة الفئران ونشر زراعة الخلايا ، وهي الفيروس العصبي المرآتي ، طرقا جديدة للتحقيق في هذه مسببات الأمراض المهمة. في هذا التقرير ، سنعرض استراتيجيتين تسمحان بتوليد عزلات الفيروسات العصبية العصبية المحددة وراثيا في زراعة الخلايا. تعتمد كلتا الاستراتيجيتين على توليد النصوص الفيروسية المتوجة في النهاية الخمسة الرئيسية.

الأول ينطوي على التخليق في تغطية الحمض النووي الريبي الفيروسي في المختبر قبل تعداء الخلايا. يستلزم النهج الثاني نسخ قارورة MI العصبية ، CDNA داخل الخلايا التي تعبر عن نظرة عامة على إجراء بوليميراز الحمض النووي الريبي T السبعة. يبدأ بروتوكول استعادة نوروفيروس العصبي من نصوص الحمض النووي الريبي المغطاة عن طريق الارتفاع الخطي.

البلازميد الذي يحتوي على MV CD NA ل mmv واحد. يتم ذلك باستخدام إنزيم التقييد NHE واحد. يتم بعد ذلك نسخ الحمض النووي في المختبر إلى الحمض النووي الريبي باستخدام بوليميراز T سبعة RNA.

بعد ذلك ، يتم تغطية M-M-V-R-N-A في المختبر ويتم نقله إلى الخلايا للسماح باستعادة التعافي المباشر MMV المعدي من MNV المعدي باستخدام فيروس FAL PX الذي يعبر عن بوليميراز T سبعة RNA لاستعادة MMV من استنساخ (كدنا) المنقولة مباشرة ، تصاب الخلايا أولا بفيروس FAL PX المؤتلف الذي يعبر عن T سبعة بوليميراز RNA FAL PX سيؤدي إلى التعبير عن بوليميراز T سبعة RNA وكذلك الحمض النووي الريبي الفيروسي إنزيمات السد التي قد تحيط ببعض الحمض النووي الريبي المركب. ثم يتم نقل M-M-V-C-D-N-A إلى الخلايا المصابة ب FPV عن طريق تعداء بوساطة الدهون. ثم ينتج بوليميراز T seven RNA M-M-V-R-N-A ، والتي قد يتم بعد ذلك تغطية بعضها بواسطة آلة السد F-P-V-R-N-A.

يضمن تسلسل زيم الريبو أن كل نسخة من الحمض النووي الريبي تحتوي على ثلاثة نهايات أولية محددة. سيتم بعد ذلك ترجمة نصوص MMV المغطاة إلى بروتين قبل النسخ المتماثل ، مما يؤدي إلى إنتاج جزيئات معدية جديدة. بروتوكول لنسخ الحمض النووي الريبي ووضع حد أقصى لاستعادة تخليق MMV المعدي لنصوص MMV المعدية.

أولا ، امزج الكواشف التالية ، والنسخ ، والنيوكليوتيدات العازلة ، والماء ، والبلازميد الخطي الذي يحتوي على M-M-V-C-D-N-A. ثم أضف الحمض النووي الريبي في بوليميراز الحمض النووي الريبي T سبعة إلى خليط التفاعل. تتوفر العديد من المجموعات التجارية لهذا الغرض وتوفر طريقة قابلة للتكرار لتخليق الحمض النووي الريبي.

يتم إجراء تفاعل النسخ عن طريق احتضان المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. قم بتحليل ألكوت صغير من تفاعل النسخ هذا على هلام agros غير متغير الطبيعة. أولا ، قم بتنظيف معدات الجل بالمنظف واغسلها بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي قبل الاستخدام.

تأكد من أن المواد الهلامية الزراعية محضرة باستخدام كواشف خالية من الحمض النووي الريبي. سيتم تشغيل M-V-R-N-A في ما يقرب من ثلاث قواعد قاتلة على جل AGRO ROSE غير المتغير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام المحلل الحيوي Agilent لتوفير طريقة سريعة لتحليل سلامة الحمض النووي الريبي.

يجب بعد ذلك تنقية الحمض النووي الريبي لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة. تتوفر العديد من الطرق ، ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، نقوم بتنقية الحمض النووي الريبي عن طريق ترسيب كلوريد الليثيوم ككريات بديلة فعالة من حيث التكلفة للحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات الشفافة واغسلها باستخدام 70٪ من الإيثانول.

أعد تعليق نسخة MMV في محلول تخزين الحمض النووي الريبي وتأكد من إذابته تماما. قد يساعد تسخين الحمض النووي الريبي إلى 65 درجة مئوية في هذه العملية لاحقا. تحديد كمية الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الطيف.

قم بتحليل سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيل حصة صغيرة على هلام agros غير متغير للطبيعة بنسبة 1٪. كما ترون ، يجب أن تظل سلامة الحمض النووي الريبي بعد ترسيب كلوريد الليثيوم كما هي لتحسين كفاءة السد. سخني كمية من الحمض النووي الريبي عند 65 درجة لمدة 10 دقائق.

ضع الأنبوب على الفور على الجليد. لتجنب التدهور أو إعادة الطي ، قم بإعداد خليط تفاعل السد على النحو الذي اقترحته الشركة المصنعة. نضيف عادة حوالي 60 ميكروغراما من M-N-V-R-N-A إلى تفاعل نهائي قدره 100 ميكرولتر.

على الرغم من أنه يمكن تقليص حجم التفاعل خلطه جيدا واحتضانه عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة ، قم بتنقية الحمض النووي الريبي عن طريق ترسيب كلوريد الليثيوم كما كان من قبل. من الضروري التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي مرة أخرى قبل الشروع في التعداد. بروتوكول خطوة لاستعادة MMV عن طريق التثقيب الكهربائي للحمض النووي الريبي في الخلايا الخام. ريسوس.

قارورة الخلايا الخام في DMEM. تأكد من تكوين معلق خلية واحدة. حدد تركيز الخلايا القابلة للحياة في مقياس الخلوي الدموي باستخدام استبعاد trian blue.

بيليه الخلايا وإعادة التشكيل بعناية. قم بتعليقها في وسائط جديدة خالية من المضادات الحيوية ، وقم بتقطيعها في جهاز تعدين صغير ، وقم بتقطيعها في جهاز تنقل صغير. قم بإزالة الوسائط واغسل الخلايا في 500 ميكرولتر من جهاز الطرد المركزي PBS مرة أخرى وقم بإزالة PBS ، وأعد تعليق الخلايا في 130 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة.

حل تعليق إعادة النيون. أضف الكمية المناسبة من الحمض النووي الريبي المغطى ، عادة 1.3 ميكروغرام لكل 130 ميكرولتر من الخلايا أي ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي لكل 6 ملايين خلية. يتم جمع الخلايا الممزوجة بالنصوص في طرف تعداء النيون سعة 100 ميكرولتر.

يجب توخي الحذر الشديد لعدم إدخال الفقاعات في هذه المرحلة. ثم يعمل الكهربائي باستخدام نبضة واحدة عند 1700 فولت لمدة 25 مللي ثانية. حرر الخلايا في أنبوب eend orph يحتوي على مل واحد من الوسائط الخالية من المضادات الحيوية.

قم بتوزيع الخلايا من الأنبوب في آبار مستقلة تحتوي على DMEM خال من المضادات الحيوية مع 10٪ FCS تحتضن الخلايا عند 37 درجة لمدة 24 إلى 72 ساعة. يتم إنشاء نصوص MMV عن طريق إتقان شفة الحمض النووي الريبي في BSR T بسبع خلايا كما كان قبل CAP MMV يتم إنشاء نصوص MMV CD nna LINEARIZATION T سبعة بوليميراز في النسخ المختبري ثم تتأثر النصوص في السد المختبري في BS RT بسبع خلايا. التربسين عبارة عن طبقة أحادية من سبع خلايا وبذور 7.5 في 10 إلى الخلايا الخمس القابلة للحياة في ستة أطباق صحائح.

احتضان الخلايا عند 37 درجة بين عشية وضحاها. قم بإزالة الوسائط من الخلايا واستبدلها بثلاثة مليل من الوسائط الطازجة التي تفتقر إلى المضادات الحيوية. لضمان أقصى قدر من كفاءة التعداء ، امزج ميكروغراما إلى ميكروغرامين من M-M-V-R-N-A المغطى مع 100 ميكرولتر من الدرجة المثلى.

امزج أيضا أربعة ميكرولترات من استئصال الدهون 2000 مع 100 ميكرولتر من الدرجة المثلى. امزج العينات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي واستئصال الدهون واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 15 مرة. اتركي الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

ثم أضف مجمعات التعدي التي تحتوي على نصوص MMV مغطاة بطريقة انخفاض السعر إلى الطبقة الأحادية للخلية. رج الطبق في اتجاهات عمودية. احتضان الخلايا لمدة 24 إلى سبع ساعتين.

بروتوكول للتعافي المباشر من MMV المعدي من CDNA في الخلايا التي تعبر عن بوليميراز T سبعة RNA كما هو موضح سابقا. يعتمد هذا البروتوكول على التعبير عن إنزيمات T seven RNA polymerase و oxx الفيروسية في الخلايا المصابة بمساعدة فيروس oxx. ثم يتم نقل M-N-V-C-D-N-A تحت سيطرة محفز T seven إلى الخلايا.

أولا ، قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا وأضف إلى كل بئر 700 ميكرولتر من فيروس F Pox المخفف في وسائط خالية من المضادات الحيوية. يتم استخدام تعدد العدوى بحوالي 0.5 PFU لكل خلية بشكل عام ، وتشكيل الصفائح بشكل عمودي واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. بعد ذلك. أضف وجبتين من الوسائط الخالية من المضادات الحيوية واحتضان الخلايا لمدة ساعة إضافية عند 37 درجة للسماح بتعبير بوليميراز الحمض النووي الريبي السبعة MNV CG NNA ، وإزالة الوسائط من الخلايا المصابة وإضافة ثلاث مطاحن من الوسائط الطازجة بدون مضادات حيوية.

تحضير خليط من ميكروغرام واحد من M-M-V-C-D-N-A واستئصال الدهون كما هو موضح في القسم السابق. تخلط جيدا عن طريق التحضير لأعلى ولأسفل. احتفظ بالأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم امزجه مرة أخرى وأضف الفطائر المتساقطة إلى طبقة الخلية الأحادية.

رج الطبق برفق في اتجاهات عمودية. احتضان الخلايا عند 37 درجة لمدة 24 إلى 72 ساعة لتأكيد تعافي MMV المعدي من خلال مناهج الوراثة العكسية المختلفة الموضحة في سياق هذا الفيديو ، وإطلاق التباين المعدي من الخلايا عن طريق الذوبان المتكرر بالتجميد. حدد في كل عينة من خلال الإجراءات القياسية مثل TCID 50 أو النتائج التمثيلية لفحص البلاك.

يوفر توافر هذه الأنظمة الجينية العكسية لدراسة الفيروس العصبي قدرة غير مسبوقة على تشريح دور التسلسلات الفيروسية في تكاثر الفيروسات العصبية والتسبب في المضيف الطبيعي. كلا نهجي علم الوراثة العكسي الموضح في هذا الفيديو فعالان للغاية لاستعادة الخلايا العصبية المعدية والفيروسات العصبية وزراعة الخلايا. كما هو موضح في هذا الشكل.

MMV المعدية ، يتجاوز العنوان 10 إلى خمسة TCID 50 لكل مل يتم استردادها بعد تعدين نصوص MM V المغطاة إما إلى خلايا خام أو BS RT سبع خلايا. يؤدي تعداء MM V-C-D-N-A إلى سبع خلايا مصابة سابقا بمساعدة فيروس الملوثات العضوية الثابتة الفاسد إلى عيارات فيروسية تتجاوز 10 إلى أربعة TCID 50 لكل مل. تتشابه العيارات الفيروسية التي تم الحصول عليها عن طريق مناهج علم الوراثة العكسية مع تيتوس الذي تم إنقاذه في الحمض النووي الريبي ، المعزول عن الفيروس المعدي ، مما يسلط الضوء على الكفاءة العالية للأنظمة الجينية العكسية الموضحة هنا.