الكم النقاط المدمجة لواحدة جزيء التصوير

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد نقاط كمومية فلورية مع سطوع واستقرار محسنين ، بالإضافة إلى تقليل الحجم والربط غير المحدد للاستخدام في تصوير الجزيء الفردي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير نوى النقاط الكمومية الصغيرة من السيلينيد الكادميوم أولا. الخطوة الثانية هي خلط هذه النوى بالزئبق لتحويل تألقها إلى الطيف الأحمر وزيادة سطوعها.

بعد ذلك ، يتم زراعة غلاف سبيكة رقيقة على بلورات النانو لتحقيق الاستقرار في انبعاثها المضان تتمثل الخطوة الأخيرة في نقل هذه الجسيمات من المذيبات العضوية إلى المخازن المؤقتة المائية باستخدام بوليمر متعدد الأسنان ، والذي يمكن تعديله باستخدام بولي إيثيلين جلايكول خامل بيولوجيا. في النهاية ، يتم استخدام قياس الطيف الفلوري ، والكروماتوغرافيا الهلامية ، والرحلان الكهربائي الهلامي لإظهار أن هذه الجسيمات لها مضان ساطع ، وحجم هيدروديناميكي مضغوط ، وسمات شحنة إلكتروستاتيكية محايدة مناسبة تماما للتصوير الفلوري لجزيء واحد في علم الأحياء.

الميزة الرئيسية لهذه النقاط الكمومية على المواد التجارية الحالية هي أن هذه الجسيمات النانوية لها حجم هيدروديناميكي منخفض بشكل كبير. على الرغم من أن النقاط الكمومية الأصغر تتأثر سلبا بانخفاض شدة التألق ، وانخفاض استقرار التألق ، والتألق فقط في الطيف الأزرق ، فقد قمنا بتعويض هذه التأثيرات باستخدام عملية تبادل كاتيون الزئبق. يمكن أن تساعد بلورات النانو هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الفيزياء الحيوية والإشارات الخلوية من خلال تمكين التصوير الديناميكي للجزيئات الحيوية المفردة في البيئات البيولوجية المزدحمة.

للبدء ، قم بإعداد محلول 0.4 مولي من السيلينيوم في الأعلى عن طريق إضافة السيلينيوم إلى 50 ملليلترا. قارورة ثلاثية العنق ، وتفريغ القارورة تحت فراغ عال وتعبئتها بالأرجون باستخدام خط عرقوب sch في ظل ظروف خالية من الهواء. أضف 10 مل من الأعلى وسخنها إلى 100 درجة مئوية مع التقليب لمدة ساعة للحصول على محلول واضح عديم اللون.

قم بتبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة واترك القارورة جانبا. أيضا ، قم بإعداد محلول أكسيد الكادميوم TDPA و ODE في قارورة 250 مليلتر ثلاثية العنق باستخدام الكميات المدرجة في البروتوكول المكتوب. مع هذا الفيديو ، قم بإخلاء المحلول باستخدام خط عرقوب أثناء التحريك.

ارفعي درجة الحرارة إلى 100 درجة مئوية وأخليها لمدة 15 دقيقة إضافية. لإزالة الشوائب ذات درجة الغليان المنخفضة تحت غاز الأرجون ، سخني الخليط إلى 300 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإذابة أكسيد الكادميوم بالكامل. سيتغير المحلول من اللون المحمر إلى المحلول الصافي وعديم اللون إلى درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف HDA إلى محلول الكادميوم ، وقم بتسخينه إلى 70 درجة مئوية وإخلاءه. بمجرد الوصول إلى ضغط ثابت ، قم بزيادة درجة الحرارة وإعادة المحلول لمدة 30 دقيقة. قم بتبديل صمام خط schlink إلى غاز خامل وأدخل المزدوجة الحرارية مباشرة في المحلول.

في ظل الظروف الخالية من الهواء ، أضف DPP إلى محلول الكادميوم وقم بزيادة درجة الحرارة إلى 310 درجة مئوية. استخدم الآن حقنة بلاستيكية يمكن التخلص منها متصلة بإبرة قياس 16 لإزالة 7.5 مل من محلول السيلينيوم العلوي 0.4 مولار. بمجرد أن تتوازن درجة الحرارة إلى 310 درجة مئوية ، اضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة على صفر درجة مئوية وقم بحقن محلول السيلينيوم العلوي بسرعة مباشرة في محلول الكادميوم.

سيتغير المحلول من عديم اللون إلى الأصفر والبرتقالي ، وسوف تنخفض درجة الحرارة بسرعة وتزيد مرة أخرى إلى حوالي 280 درجة مئوية. أصعب خطوة في هذا الإجراء هي حقن الحجم الكامل للحقنة في أسرع وقت ممكن في محلول الكادميوم. هذا يضمن أن الجسيمات تنوي بشكل متجانس.

بعد دقيقة واحدة من التفاعل ، قم بإزالة القارورة من عباءة التسخين وتبرد بسرعة بتيار من الهواء حتى تصبح درجة الحرارة أقل من 200 درجة مئوية. عندما تصل درجة الحرارة إلى حوالي 40 درجة مئوية ، قم بتخفيفها ب 30 مل من الهكسان ، فإن معظم سلائف الكادميوم المتبقية ستستقر خارج المحلول. قم بإزالة هذا الراسب عن طريق الطرد المركزي.

في كل من أنابيب الطرد المركزي المخروطية سعة 50 مليلتر من مادة البولي بروبيلين المخروطي ، قم بتخفيف 12 مل من محلول نانو كريستال الخام الناتج. مع 40 مل من الأسيتون بعد الطرد المركزي بنفس المعلمات ، قم بصب المادة الطافية بعناية والتخلص منها. بعد ذلك ، قم بإذابة كريات نانو كريستال في الهكسان.

استخرج المحلول بحجم متساو من الميثانول مع الاحتفاظ بالمرحلة العليا. كرر هذا الاستخراج مرتين أخريين للاستخراج الثالث. يمكن تعديل حجم الميثانول إلى حوالي 15 ملليلترا للحصول على محلول هكسان مركز من النقاط الكمومية لسيلينيد الكادميوم النقي عند حوالي 200 ميكرومولار.

العائد النموذجي لهذا التفاعل هو ثلاث بلورات من سيلينيد الكادميوم الميكرومولار بقطر اثنين وثلاثة نانومتر تحدد قطر وتركيز النانو كريستال عن طريق قياس طيف الامتصاص المرئي للأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح في الإجراء المكتوب ، يمكن تبادل بلورات النانو جزئيا مع الزئبق إلى الانزياح الأحمر ، والامتصاص وانبعاث التألق. للقيام بذلك في قارورة زجاجية سعة 20 ملليلتر مع شريط تحريك ، اخلطي الهكسان والكلوروفورم ، ثم أضف محلول النقطة الكمومية السيلينيد الكادميوم OLA وينتهك أوكتان الزئبق. بعد تنقية بلورات النانو وتحديد تركيزها كما هو موضح في الإجراء المكتوب ، اسمح لبلورات النانو بالتقدم في العمر لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة لنمو القشرة.

قم بإعداد محاليل سلائف قذيفة 0.1 في 50 مليلتر ، وثلاث قوارير عنق تحت محاليل حرارية فراغية من سلائف الكادميوم ، وسلائف الزنك ، وسلائف الكبريت للارتجاع لمدة ساعة واحدة للحصول على محاليل واضحة ، ثم اشحنها بالأرجون إلى قارورة ثلاثية العناق. أضف topo ODE والنقاط الكمومية لسيلينيد الكادميوم الزئبق المحضر. قم بإخلاء السداسي في درجة حرارة الغرفة باستخدام خط الخاصرة.

ارفعي درجة الحرارة إلى 100 درجة مئوية وارتفعي لمدة 15 دقيقة. قم بتغيير صمام الخط إلى غاز الأرجون وأدخل المزدوجة الحرارية في محلول نانو كريستال. بعد زيادة درجة الحرارة إلى 120 درجة مئوية ، أضف 0.5 طبقة أحادية أو 140 ميكرولتر من محلول سلائف الكبريت واترك التفاعل يستمر لمدة 15 دقيقة.

ارفعي درجة الحرارة إلى 140 درجة مئوية. أضف 0.5 طبقة أحادية أو 140 ميكرولتر من محلول سلائف الكادميوم واترك التفاعل يستمر لمدة 15 دقيقة. ثم أضف 500 ميكرولتر من OLA اللامائي إلى محلول التفاعل.

أضف 160 درجة مئوية ، أضف 0.5 طبقة أحادية ، أو 220 ميكرولتر من محلول سلائف الكبريت ، متبوعا بكمية متساوية من محلول سلائف الزنك عند 170 درجة مئوية مع 15 دقيقة بين كل إضافة. ثم عند 180 درجة مئوية ، أضف 0.25 طبقة أحادية ، أو 150 ميكرولتر من محلول سلائف الكبريت ومحلول سلائف الزنك على فترات 15 دقيقة. برد. الحل لدرجة حرارة الغرفة ومعامل انقراض جديد لهذه الجسيمات.

باستخدام طيف الأشعة فوق البنفسجية ، بافتراض أن عدد بلورات النانو لم يتغير ، قم بتخزين محلول التفاعل كخليط خام في الفريزر. في هذه المرحلة ، يمكن تمييز بلورات النانو باستخدام المجهر الإلكتروني والتحليل الطيفي لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية والتحليل الطيفي الفلوري. أضف نقاطا كمومية من القشرة الأساسية المنقاة إلى قارورة ثلاثية العنق سعة 50 مليلتر وقم بإزالة الهكسين تحت فراغ عالي.

للحصول على فيلم جاف ، املأ القارورة بالأرجون. أضف البيورين اللامائي إلى فيلم الجسيمات النانوية وقم بتسخين الملاط إلى 80 درجة مئوية على مدار ساعة إلى ساعتين. سوف تذوب الجسيمات النانوية تماما.

أضف ملليلترا واحدا من الجلسرين FIO إلى المحلول وحركه على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد تبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 0.5 مل من ثلاثي إيثيل أمين لإزالة بروتون ثيو الجلسرين وحرك لمدة 30 دقيقة. قد يصبح المحلول غائما بعد إضافة ثلاثي إيثيل أمين بسبب ضعف قابلية الذوبان لبلورات النانو القطبية في خليط المذيبات هذا.

انقل محلول النقطة الكمومية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على خليط من 20 مل من الهكسان و 20 مل من الأسيتون واخلطه جيدا. عزل بلورات النانو المترسبة عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بغسل الحبيبات بالأسيتون ، قم بإذابة بيليه النقطة الكمومية في خمسة ملليلتر من DMSO مع صوتنة الحمام واتبعه بالطرد المركزي. لإزالة الركام المحتمل ، حدد تركيز الجسيمات النانوية من طيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.

يجب استخدام محلول النقاط الكمومية النقية في غضون ثلاث ساعات حيث يمكن أن يتأكسد السطح ببطء في ظل الظروف المحيطة في الهواء. قم بتخفيف محلول النقطة الكمومية إلى 10 ميكرومولار أو أقل باستخدام DMSO ونقله إلى قارورة سعة 50 ملليلترا. أضف محلول محضر من خمسة ملليغرام لكل مليلتر من حمض البولي أكريليك الموسع في DMSO ، بالتنقيط إلى محلول النقطة الكمومية أثناء التقليب وإزالة الغاز من المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

قم بتطهير محلول بوليمر النقطة الكمومية بالأرجون وقم بتسخينه إلى 80 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد تبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف حجما متساويا من 50 مللي مولار من الصوديوم يؤكل درجة الحموضة ثمانية قطريا ويقلب لمدة 10 دقائق. قم بتنقية النقاط الكمومية كما هو موضح في الإجراء المكتوب وحدد التركيز من طيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية في قارورة زجاجية سعة أربعة ملليلتر مع شريط تحريك ، وامزج نقطة كمية خلد واحدة في عازلة البورات مع 40،000 مرة زائدة مولار من 750 دالتون أحادي بولي إيثيلين جلايكول.

يمكن العثور على التعليمات في الإجراء المكتوب حول كيفية إضافة وظائف كيميائية محددة إلى بلورات النانو. أضف بسرعة 25،000 مرة من الفائض المولي من محلول المحضر حديثا لمحلول عامل التنشيط إلى محلول النقطة الكمومية وحركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة أربع مرات أخرى لتشبع سطح النانو كريستال باستخدام PEG.

أخيرا ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن مؤقت مولار واحد لإخماد التفاعل قبل تنقية بلورات النانو باستخدام مرشحات الطرد المركزي لغسيل الكلى أو الطرد المركزي الفائق ، يمكن تحليل الأقحوان النانوي الناتج من أجل الحجم الهيدروديناميكي أحادي التشتت والشحنة السطحية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة والرحلان الكهربائي للهلام والفحص المجهري الفلوري. يظهر هنا أطياف امتصاص وفلورية تمثيلية لبلورات نانو سيلينيد الكادميوم ، والزئبق ، والكادميوم ، والسيلينيد ، وبلورات النانو بعد تبادل التcadion ، وسيلينيد الكادميوم الزئبقي الأساسي ، والكادميوم ، وبلورات نانو كبريتيد الزنك بعد نمو القشرة. تتمتع بلورات النانو السيلينيد الكادميوم الأساسية بعائد كمي من التألق بالقرب من 15٪ ومع ذلك ، تنخفض هذه الكفاءة إلى أقل من 1٪ بعد تبادل الزئبق ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى مصائد حاملة الشحنة التي يتم إدخالها من خلال اضطراب الذرة السطحية.

يعزز نمو قشرة رقيقة من كبريتيد الزنك الكادميوم هذه الكفاءة إلى أكثر من 70٪ والتي يتم الحفاظ عليها إلى حد كبير بعد نقلها إلى الماء. في المقابل ، تفقد سيلينيد الكادميوم الأساسي ، والكادميوم الصدفة ، وبلورات النانو لكبريتيد الزنك بدون دمج الزئبق جزءا كبيرا من إنتاجها الكمي في الماء ما لم تزرع قشرة سميكة. من المهم ملاحظة أن السد بكبريتيد الزنك الكادميوم يحول الأطياف إلى اللون الأحمر بسبب تسرب ناقلات الشحنة الإلكترونية إلى مادة الغلاف.

يتراوح هذا التحول بين 20 و 30 نانومتر لنوى الكادميوم الأساسية ويزداد مع زيادة محتوى الزئبق في القلب. وبالتالي ، من خلال دمج الزئبق في البلورة النانوية الأساسية ، يمكن الحفاظ على الحجم الصغير لنانو كريستال دون التضحية بالسطوع. يظهر الحجم الصغير في هذا التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال وتوزيع حجم الجسيمات للب الزئبق والكادميوم والسيلينيد والكادميوم وبلورات النانو لكبريتيد الزنك التي تظهر متوسط قطر 3.2 زائد أو ناقص 0.6 نانومتر.

استخدام نقل الطور المكون من خطوتين إلى الماء أمرا بالغ الأهمية للحصول على مجموعة متجانسة من بلورات النانو التي لا تتطلب مزيدا من فرز الحجم لإزالة المجموعات وتجميعها لاستبعاد الحجم. يؤكد الكروماتوجرام الموضح هنا أن الحجم مشابه لحجم الألبومين المخدع. عند 75 كيلودالتون وبعد التعديل مع 750 دالتون أمينو PEG ، يتم زيادة الحجم إلى 12 نانومتر فقط ، على غرار الجسم المضاد IgG.

يعمل تعديل PEG على تحييد الشحنة السطحية كما هو مؤكد في تجربة الرحلان الكهربائي لهلام aros الموضحة هنا ، ويتم تمييز البئر بسهم ويشار إلى أقطاب القطب الكهربائي على اليمين مما يدل على أنه قبل الاقتران تهاجر بلورات النانو كجزيئات أوانيك وأن بلورات النانو المبتذلة تكون محايدة إلكتروستاتيكا. يظهر هنا صورة مجهرية مضان epi لهذه البلورات النانوية المودعة على زلة غطاء زجاجي ومتحمسة بضوء مرئي 545 نانومتر. يتم ملاحظة هذه البلورات النانوية بسهولة على مستوى الجزيء الفردي بمعدل 30 إطارا في الثانية باستخدام كاميرا CCD التي تضاعف الإلكترون.

توضح هذه المؤامرة أن عدد جزيئات الفلورسنت التي لوحظت في كل إطار يتقلب بمرور الوقت مع الإثارة المستمرة. هذا يرجع إلى مزيج من الوميض وتدهور الصورة. يهيمن الوميض في الدقائق السبع الأولى قبل أن يصبح تدهور الصورة التأكسدي واضحا ببطء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع النقاط الكمومية كيميائيا ، وكيفية نقلها إلى مخازن مائية ، وكيفية تعديلها لتطبيقات التصوير الحيوي. لا تنس أن العمل مع الكواشف التي تحتوي على الكاديوم والزئبق يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب اتخاذ احتياطات إضافية لمنع التعرض الشخصي.