رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Hi.In هذا الفيديو نقدم تجربة تتبع كمي واحدة كاملة. تم تصميم خوارزمية مخصصة بالكامل بالتعاون مع خبراء ISIS للصور. خلال هذا الفيديو، سنستخدم مستقبل عامل نمو البشرة كنموذج لوصف طريقة هذه التقنية.

مستقبل عامل نمو البشرة هو بروتين عبر الغشاء. سيتم تمييز هذا المستقبل باستخدام جسم مضاد وحيد النسيلة ، والذي يتم تقليله للاحتفاظ فقط بجزء A a B. يتم إيوتينيل جزء A a B ، وبعد ذلك ، يرتبط بالستربتافيدين للنقطة الكمومية ، سيتعرف نظام الجدار بدقة على مستقبل EGF.

هدفنا هو توفير رؤية شاملة لديناميكيات مستقبلات سطح الخلية. في الواقع ، يمكن أن تنحرف المسارات الجزيئية عن الانتشار الأحجار الكريمة من خلال حصرها في مجالات النانو. على سبيل المثال ، وقد يكون هذا توقيعا على تفاعل أساسي مع ، على سبيل المثال ، شركاء الإشارة أو السقالات الجزيئية.

نهدف إلى وصف مثل هذه الأحداث بشكل شامل من خلال تعيينها فوق الخلية ، الأمر الذي يتطلب العمل بدقة زمنية عالية ل SPECT جنبا إلى جنب مع كثافة وضع العلامات العالية. ومن ثم نطلق على هذا النهج اسم التتبع متعدد الأهداف. الخطوة الأولى من التجربة هي تحضير العينة.

نحن نعمل على الخلايا الحية بدون مضادات حيوية. هنا نستخدم سبع خلايا تكلفة, التي تعبر داخليا عن مستقبلات EGF. بعد فصل الخلية ، نحتاج إلى التأكيد بدقة من أجل الحصول على نفس عدد الخلايا في بئر المختبر.

العدد الدقيق للخلايا مهما جدا لزيادة القدرة على التنبؤ بعدد النقاط الكمومية لكل خلية بعد توزيع الخلية في H ، حسنا ، تحتاج إلى احتضان الشفرة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مع 7٪ من ثاني أكسيد الكربون2. الخطوة التالية هي تحضير النقطة الكمومية المقترنة بالأجسام المضادة. النقاط الكمومية هي جسيمات نانوية فلورية صغيرة.

هذه الجسيمات لها اهتمام كبير جدا هنا لأنها ساطعة ومستقرة للغاية مقارنة بمسبار الفلورسنت الكلاسيكي والإشارة. نسبة الأنف مهمة جدا لهذا النوع من التجارب. في هذه الحالة ، نستخدم وسيطا كاملا لتشبع الشريط حول النقاط الكمومية ولمنع التجميع.

بعد ذلك ، كان لدينا النقاط الكمومية في البروتين المبتهج بالذكاء الحيوي أو الأجسام المضادة ذات الأهمية بنسبة واحد إلى واحد من أجل الحصول على نقاط كمومية أحادية التكافؤ إحصائيا. في هذه التجربة ، نستخدم جزءا من a b ضد مستقبلات EGF المنتجة في المختبر من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة والتي تستهدفها البيوتين. أثناء الحضانة حوالي 15 دقيقة ، يمكنك الحفاظ على التحكم تحت التجميع والتجانس باستخدام شاكر عند 1 ، 200 دورة في الدقيقة واثنين من خمس درجات.

عندما يصبح المزيج جاهزا ، يمكنك إضافته إلى خلاياك. قم بإزالة الوسط من البئر برفق شديد لمنع انفصال الخلية على تقنية المختبر وأضف الكمية اللازمة من المزيج لتجربتك. في هذه الحالة ، سنضيف 100 ميكرولتر من المزيج لكل بئر.

بعد إضافة المزيج ، يمكنك احتضان خليتك لمدة 15 دقيقة. في هذه الحالة عند 37 درجة مع 7٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد هذه الحضانة ، قد تجد عددا كبيرا من النقاط المزدوجة المتكررة في التعليق على الوسط.

يجب إزالة هذه النقاط الكمومية قبل التصوير. بسبب الضوضاء التي نحضرها. لهذا السبب نحتاج إلى غسل كل منها ، جيدا عدة مرات في هذه الحالة ، خمس مرات لغسل أنفسكم.

استخدم وسيط التصوير مع غير التألق الذاتي. هنا نستخدم المخزن المؤقت HBSS مع aps. الآن خلاياك جاهزة.

حان الوقت للذهاب إلى الإعداد للاستحواذ. يتكون الإعداد من أربعة أجزاء رئيسية ، مجهر مقلوب ، كاميرا ذات حساسية للعين ، مصباح زئبق قوي ، وحاضنة للحفاظ على الخلية عند 37 درجة. يمر الضوء المنبعث من مصباح الزئبق عبر ألياف وعبر عجلة مرشح قبل إضاءة العينة.

يتم تصفية الأنفلونزا eSense للعينة وجمعها بواسطة كاميرا E-M-C-C-D على اليسار. نحن نستخدم حاليا 1.3 و 1.49 تاجر زيت الفتحة العددية للأهداف. الخطوة المركزية لهذه التجربة هي الاستحواذ في حد ذاته.

بمجرد أن تصبح الخلايا في بؤرة التركيز ، ننظر إلى واحدة تمثيلية ذات ملصق قوي. في النقاط الكمومية ، نحصل أولا على صورة واحدة في الضوء الأبيض المنقول ، والتي يمكن استخدامها أيضا للتحقق من جانب الخلية والحد الخاص ل LA podia. ثم نحصل على الفيديو عادة بمعدل 36 مللي ثانية ، وهو أسرع معدل مسموح به في الإطار الكامل.

نستخدم إلكترون يضرب CCD للوصول إلى حساسية جزيء واحد مع إشارة كافية إلى نسبة الشمال أعلى من 20 ديسيبل على الأقل. عادة حوالي 25 ديسيبل ، وعادة ما نحصل على 300 إطار. لتقييم مجموعة بيانات معينة ، ما عليك سوى توفير البطاقة إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات الفيديو.

ثم كتابة الأمر ، يعيد النص الاتصال في MetLab أو الأمر MTT 23 I ، والذي يعرض أولا قائمة واجهة رسومية. ستبدأ جميع المعلمات المستخدمة في التحليل الآلي بالكامل. يتم إجراء تحليل MTT الأساسي على كل إطار ، مع استدعاء ثلاث مهام رئيسية ، الكشف الأول لكل بكسل لوجود أو عدم وجود دين كمي مستهدف.

ثم لكل تقدير للكشف عن المعلمات ذات الصلة المستهدفة مثل موضع البكسل وشدة الإشارة وما إلى ذلك. آخر إعادة اتصال للأهداف الجديدة. مع الآثار التي تم إنشاؤها بالفعل على الإطارات السابقة لكل بكسل.

بالنظر إلى منطقة فرعية محلية ، نقارن بين وجود فرضيتين ، إما ضوضاء فقط أو إشارة. مع وظيفة انتشار النقاط ، يكون لدى ModuLite ذروة هين. نحن نستخدم عتبة تضمن إنذارات كاذبة منخفضة بما فيه الكفاية مع أقل من اكتشاف واحد لكل إطار لكل هدف تم اكتشافه.

نقوم بعد ذلك بإجراء أقدام مغذية شبح مربعة أقل لتقدير موضع العرض وارتفاع Goshen المكتشفة. يوفر هذا بشكل ملحوظ موضع الخلية الشوكية للصبغة ، وعادة ما تكون دقة حوالي 10 إلى 20 نانومتر لنسب الإشارة إلى الضوضاء النموذجية عند قمم الكثافة العالية غالبا ما تكون مغلقة جدا وقد تعيق القمم القوية الأضعف للتعامل مع ذلك. نقوم بتفريغ القمم المكتشفة من الصورة الأولية قيد التشغيل.

مرة أخرى ، يمكن أن يؤدي الكشف على المتبقية عادة إلى انحراف 10٪ من القمم. يعد الوصول إلى اكتشاف شامل تقريبا مثمرا للغاية لإعادة الاتصال بدقة. ثم تتم مطابقة مجموعة الأهداف الجديدة مع مجموعة الآثار السابقة لهذا التلميذ.

من أجل تعيين كل تتبع لهدف إن أمكن ، والتعامل مع الوميض المحتمل ، نستخدم جميع المعلومات الإحصائية المتاحة التي يتم الحصول عليها من خطوة الكشف. وبالتالي ، لا يتم تعيين الأهداف فقط لأقرب أثر. في حالة التعارضات ، عندما تتقاطع الآثار ، مما يعني أن المناطق ذات الصلة من البحث المتداخلة ، سننظر في القيمة الإحصائية للكثافة والسرعة والعرض والوميض لكل من الآثار والأهداف.

يوفر هذا درجة إعادة الاتصال المثلى إحصائيا. تسمح الإستراتيجية بالتجنب عندما يكون ذلك ممكنا ، وتحيز إعادة الاتصال نحو أقرب الجيران ، مما يعني أبطأ حركة. نستخدم بعد ذلك وظيفة لتقييم الحبس العابر المحتمل داخل المسارات.

ترتبط هذه الوظيفة عكسيا بالانتشار المحلي كما أنشأه سيكستون سيمبسون والمتعاونون. يسمح تطبيق الحد بتحديد الحلقات المحصورة أو غير المحصورة. من خلال تكرار هذه الآثار الشاملة ، يمكننا أخيرا تعيين ديناميكيات الغشاء من حيث الحبس العابر ، وأدلة التباطؤ ، ويمكن تمثيل ذلك.

بدلا من ذلك ، باستخدام القيم الثنائية أو المنفصلة لمؤشر الحبس هذا ، بشكل افتراضي ، ستقوم MTT بتنفيذ هذه المهام تلقائيا ، مع حفظ معلمات الصف لكل ذروة في ملف eski لكل فيديو ، ولمزيد من التحقيقات المتقدمة. النتائج النموذجية مثل خريطة الآثار فوق كل خلية ورسم الرسوم البيانية للمعلمات ذات الأهمية ، وشدة الذروة ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وقيم النقص المحلية ، وبالتالي يمكن أيضا تكييف هذا الجانب بسهولة مع أي تحقيق مخصص. سيلخص هذا الفيديو الآن النتائج النموذجية التي حصلت عليها MTT.

يكمن جزء كبير من العمل في تطوير الخوارزمية ، والتي قد تحتاج إلى تكييفها مع التحقيقات المخصصة مثل أنماط الحركة أو التفاعلات التي تعاني منها. لكن تشغيل MTT بسيط للغاية. يجب على المستخدمين تحسين بعض المعلمات فقط مثل حدود المساحة والوقت.

عند تطوير MTT ، كنا نهدف إلى إعادة النظر بالكامل في الخيارات التحليلية المستخدمة لكل مهمة. نقوم بتحسين العملية على طول محورين صعبين. أولا ، التعامل مع الكثافات العالية للحصول على أفضل المعلومات الخاصة على سطح السطح ، وثانيا ، يمكن تفسير التعامل مع SNR الضعيف ، والذي يسمح عادة بالعمل عند التخلص المنخفض والحبس عالي السرعة على أنه توقيع للتفاعل الأساسي.

قد تتفاعل مستقبلات الغشاء مع الهيكل الخلوي للغشاء الفرعي أو مجالات الدهون المؤيدة ، على سبيل المثال. يمكن التحقيق في مثل هذه الأحداث من خلال اختلافات الحبس في المكان والزمان. ويمكن مقارنة التدابير الدينامية بالنهج التكميلية مثل FRA والحد الأدنى للشحن أو النقل.

الكود مفتوح المصدر متاح للبحث الأكاديمي. يمكن تنزيله من صفحة الويب الخاصة بنا على CML dot univ إذا كان S fr على صفحة فرقنا ، والتي توفر رابطا للتنزيل. كما نرحب بالصناعات المهتمة للاتصال بنا.

أن نشكر بشكل خاص أعضاء فريقنا والمرافق المشتركة على الدعم والمناقشات المثمرة. يتم دعم هذا المشروع بتمويل من CNRS في c MAA University Pac Region National de La ، ويتم دعم Foundation Medical من قبل مراقب الدوري. شكرا للمشاهدة.