الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

يتمثل الهدف العام من هذه الطريقة في استخدام صبغات تتبع الخلايا للقياس الكمي المباشر لمدى انقسام الخلايا لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية ضمن مجموعات خلوية معقدة. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق وسم مجموعة الخلايا الأم بصبغة فلورية معروفة بقدرتها على الارتباط المستقر ببروتينات الخلية أو التداخل غير التساهمي في الأغشية الخلوية لتتبع الخلايا المصبوغة التي تستجيب للمحفزات؛ حيث يسمح التلوين بالأجسام المضادة الفلورية والتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات بالكشف عن الاستجابات المتفاوتة بين أنواع الخلايا المناعية المحفزة ذات الصلة. أما الضوابط غير المصبوغة بصبغة التتبع، فتستخدم لتحديد أدنى شدة فلورية للخلايا الوليدة يمكن تمييزها عن الفلورة الذاتية. ثم تُستخدم الضوابط المصبوغة بصبغة التتبع ولكن غير المحفزة لتحديد شدة الفلورة التي سيتم عندها الكشف عن الخلايا غير المنقسمة. وعادة ما يؤدي التحفيز إلى نطاق واسع من الشدات، حيث تصبح الخلايا التي تتكاثر استجابة للمحفز خافتة تدريجياً، بينما لا يحدث ذلك في الخلايا غير المستجيبة.

وفي نهاية المطاف، يمكن أن يسمح استخدام برنامج نمذجة القمم لتقدير التردد النسبي للخلايا في الأجيال المختلفة بإجراء مقارنة كمية للاستجابات التكاثرية عبر المجموعات أو المحفزات المختلفة باستخدام مقاييس مثل مؤشر التكاثر أو تردد الخلايا السليفة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل دمج الثيميدين المسمى بالتريتيوم أو تعبير KI 67، في أن تخفيف صبغة DI يوفر قياساً مباشراً لانقسام الخلايا، والذي يمكن دمجه مع مقاييس أخرى لقياس التدفق الخلوي مثل التنميط المناعي وإنتاج السيتوكينات. ويعد التوضيح المرئي لطريقة صبغ الغشاء مفيداً لأن امتصاص الخلايا للصبغة يكون سريعاً للغاية.

وبناءً على ذلك، فإن التقنية الجيدة هي المفتاح للحصول على صبغ ساطع ومتجانس. بعد عزل الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي البشري، يتم إجراء عملية الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 300 ×g في درجة حرارة الغرفة لتقليل تلوث الصفائح الدموية. ثم يتم إعادة تعليق الراسب بكثافة 10⁷ خلية لكل ملليلتر في محلول HBSS مضاف إليه 1% BSA، وتوضع الخلايا على الثلج.

قم بإزالة وحجز 500 µL من العينة، ثم انقل 500 µL أخرى من الخلايا إلى أنبوب بولي بروبيلين مخروطي بحجم 12 × 75 mm. أضف 3.5 mL من HBSS وقم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 400 ×g وفي درجة حرارة الغرفة. خلال عملية الغسيل، أضف 0.5 mL من وسيط التوسيم diluent C من طقم PKH 26 GL إلى أنبوب بولي بروبيلين مخروطي آخر بحجم 12 × 75 mm. قم بشفط السائل الطافي بعناية مع ترك ما لا يزيد عن 15 إلى 25 µL من السائل المتبقي، مع الحرص على عدم إزالة أي من الخلايا. بعد ذلك، أضف 0.5 mL من وسيط التوسيم diluent C إلى كتلة الخلايا المترسبة، وقم بشفط المحلول وتوزيعه عدة مرات للحصول على معلق خلوي أحادي.

قم الآن بتحضير المخزون المركز من صبغة XD بإضافة 2 µL من PKH 26 إلى الأنبوب الذي يحتوي على diluent C. والآن، قم بنقل معلق الخلايا فوراً بواسطة الماصة إلى محلول صبغة 2 XPKH 26 المحضر حديثاً، ومع ذلك قم بسحب وتفريغ الخليط عدة مرات في آن واحد لتوزيع الخلايا بشكل متجانس في جميع أنحاء الصبغة. بعد مرور دقيقة واحدة، أضف 1 mL من المصل المثبط حرارياً لإيقاف امتصاص الصبغة في أغشية الخلايا. بعد إجراء عملية الطرد المركزي للخلايا، اسحب السائل الطافي بعناية دون إزالة الراسب.

بعد ذلك، قم بتشتيت الراسب في أربعة ملليلترات من الوسط الكامل الذي يحتوي على 10% مصل خامل حرارياً، وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب بولي بروبيلين جديد. اغسل الخلايا مرتين في HBSS مضاف إليه 1% BSA؛ حيث ستظهر الخلايا المصبوغة بشكل كافٍ صبغة وردية مميزة في الراسب. بعد إعادة تعليق راسب الخلايا في واحد ملليلتر من HBSS مضاف إليه 1% BSA، قم بعد الخلايا ثم اضبط الحجم للحصول على تركيز نهائي قدره 10⁷ خلية لكل ملليلتر. بعد صبغ الخلايا وفقاً لبروتوكول قياس التدفق الخلوي الموضح في الجدول، استخدم الأنابيب الخمسة الأولى لضبط معايير التشتت الأمامي والتشتت الجانبي والإشارات في جميع كواشف الفلورسنت الأربعة.

وبالأخص بالنسبة للكاشف المستخدم لمراقبة فلورية PKH 26 في الأنبوب الثاني، تحقق من أن جميع الخلايا المصبوغة بـ PKH 26 تظهر على المقياس كقمة متماثلة واحدة في العقد الثالث إلى الرابع مع وجود عدد قليل من الخلايا أو عدم وجودها في القناة الأخيرة. بعد ذلك، استخدم برنامج تعويض الألوان وملفات نمط القائمة التي تم جمعها للأنابيب من واحد إلى خمسة لإنشاء مصفوفة تداخل الألوان لكل فلوروكرم في الكواشف المستخدمة لمراقبة الفلوروكرمات الثلاثة الأخرى.

بعد ذلك، قم بتطبيق هذه المصفوفة على ملف وضع القائمة (list mode file) للعينة السادسة، للتحقق من أن وجود وسم PKH 26 لا يؤثر على القدرة على الكشف عن الخلايا الإيجابية لـ 7-AAD. الآن، قم بتطبيق مصفوفة تداخل الألوان التي تم إنشاؤها للتو على ملف وضع القائمة للأنبوب السابع.

حدد المجموعات السكانية CD3 موجبة CD4 سالبة و CD3 موجبة CD4 موجبة في مخطط FE مقابل PC. تأكد من أن وجود anti-CD3 و FE و anti-CD4 في الـ PC لا يؤثر على القدرة على اكتشاف الخلايا 7-AD موجبة. أخيراً، قم بتطبيق مصفوفة تداخل الألوان للأنبوب 7 على ملف وضع القائمة (list mode file) للأنبوب 8.

افتح الآن برنامجًا يحتوي على وحدة تحليل التكاثر. قم بتحميل ملف صبغة PKH 26 المحفزة من مجموعة البيانات المراد تحليلها. بعد ذلك، حدد معاملات التحليل في هذه الحالة، بحيث يتم تحديد PKH 26 ضمن بوابة الخلايا اللمفاوية الحية التي تكون سالبة لـ seven a a d وموجبة لـ cd3، مع استخدام التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي لاستبعاد الحطام الصغير والتجمعات الكبيرة.

عند تحديد هذه المناطق، احرص على تضمين منطقة التشتت الأمامي العالي حيث توجد الخلايا المتفجرة عادةً. بعد ذلك، افتح معالج التكاثر. انقر فوق علامة التبويب "البدء" لفتح ملف البيانات، ثم قم بتحميل عنصر التحكم الموجب PKH 26 غير المحفز.

حدد موقع القمة الأبوية المقابلة للخلايا غير المنقسمة. قم بتحليل الملف مع تدوين قيم موقع القمة الأبوية وعرضها. إذا كنت ترغب في تثبيت عرض القمة، فقم بتفعيل خيار "lock SD" ثم قم بتحميل عينة الضابط السلبي لصبغة PKH 26، واضبط عدد الأجيال عن طريق تعيين القناة القمية لجيل البنات الثنائي فوق الخلايا الضابطة السلبية لصبغة PKH 26.

يحدد هذا عدد أجيال الخلايا الوليدة. ويمكن للنموذج أن يتطابق بدقة عند اكتماله. أعد تحميل ملف PKH 26 الموجب المحفز.

إذا كانت القمم الجيلية المتميزة واضحة، فاختر إعداد "floating" ضمن خيار النموذج (model option). وإذا لم تكن العقود اللوغاريتمية (log decades) 4.0 بالضبط، فقم بتعديل التباعد الجيلي كما هو موضح في المقال. والآن، قم بتحليل العينة المحفزة وتأكد من أن منطقة موقع القمة الأبوية تظل دون تغيير.

أخيرًا، اختر "تحليل" (analyze) لكل ملف تجريبي في مجموعة البيانات لتطبيق النموذج الذي تم إنشاؤه للتو، ثم سجل مقاييس التكاثر المطلوبة الناتجة عن أفضل مطابقة لكل ملف تجريبي في مجموعة البيانات. توضح هذه السلسلة الأولى من البيانات تأثير تقنية الخلط على توزيعات فلورة PKH 26.

عند استزراعها، صُبغت الخلايا النقوية من سلالة U 9 37 بصبغة تتبع الخلايا باستخدام الطريقة الموصوفة للتو؛ ويظهر المخطط البياني الأول بيانات العينة الضابطة غير المصبوغة. تم ضبط إعدادات مقياس التدفق الخلوي لوضع الفلورة الذاتية لهذه الخلايا في العقد الأول، مع عدم تراكم خلايا أو تراكم عدد قليل جداً منها في القناة الأولى. ويوضح المخطط البياني الثاني صبغاً جيداً باستخدام PKH 26.

أدى الخلط السريع لـ two x من الخلايا مع two x من الصبغة إلى توزيع فلوري ساطع ومتجانس ومتماثل، دون وجود خلايا خارج نطاق المقياس وفق إعدادات الجهاز المستخدمة في المخطط التكراري السابق. وعند إضافة two x من الخلايا إلى two x من الصبغة دون خلط فوري، تم الحصول على توزيع فلوري أكثر تباينًا. هذه المجموعة الفرعية الصغيرة من الخلايا ذات الوسم الباهت قد تُفسَّر بشكل خاطئ على أنها خلايا وليدة إذا ظهرت في نقطة زمنية لاحقة في المخطط التكراري النهائي لهذه التجربة؛ كما حدث خلط رديء عندما أُضيف عن طريق الخطأ 3 µL من مخزون صبغة الإيثانول المركز مباشرة إلى 0.5 mL من معلق خلايا two x، مما أدى إلى توزيع لكثافة الفلورة باهت للغاية ومنحرف جهة اليمين.

تظهر هنا النتائج النموذجية لتجربة تكاثر، حيث تم استزراع خلايا الدم المحيطية أحادية النواة البشرية المصبوغة بـ PKH 20 مع أو بدون الكواشف المحفزة Anti CD three و IL two. وبعد 96 ساعة من الاستزراع، تم حصاد الخلايا وصبغها بصبغة مضادة باستخدام anti CD three FE و anti CD 19 A PC و seven A a d.

تمت مقارنة استراتيجيتين مختلفتين لتحديد البوابات؛ في استراتيجية تحديد البوابات الأولى، استُخدم مخطط نقطي لـ CD3 مقابل 7-AAD لاختيار خلايا T الحية والسالبة لـ 7-AAD والموجبة لـ CD3. ثم استُخدمت منطقة التشتت الأمامي والجانبي لاستبعاد التجمعات الكبيرة مع الإبقاء على اللمفاويات الكبيرة (blasting lymphocytes).

تتمثل الأحداث التي تم تحديدها عبر البوابات R one plus R two للعينة الضابطة غير المصبوغة في المدرج التكراري الرمادي، بينما تظهر الخلايا المصبوغة بـ PKH 26 ولكن غير المحفزة باللون الأزرق؛ يلاحظ وجود تصبغ متجانس ومتماثل ساطع للخلايا التائية الحية وغير المنقسمة في العينة الضابطة غير المحفزة. تم تحديد هذه البيانات عبر البوابات بنفس طريقة الشكل السابق، ولكن في هذه الحالة، تم تحفيز الخلايا باستخدام anti CD three و IL two. يحتوي المدرج التكراري لـ PKH 26 للأحداث المحددة عبر البوابات R one plus R two الآن في الغالب على خلايا منقسمة ذات شدة منخفضة، ممثلة بقمم ملونة لكل جيل من الخلايا الوليدة.

على الرغم من أن بعض الخلايا الساطعة غير المنقسمة لا تزال موجودة في ذروة الخلايا الأبوية الزرقاء. لاحظ أن كثافة الخلايا عالية الانقسام لا تتداخل بعد مع المنطقة التي يتم فيها قياس الخلايا غير المصبوغة، وهو أمر من شأنه أن يؤدي إلى تضارب في تقدير المقاييس القائمة على عدد الخلايا في أجيال الخلايا الوليدة ذات الكثافة الأدنى هنا. تم تحليل البيانات نفسها كما في مجموعتي الأشكال السابقتين، ولكن تم استخدام تشتت الضوء و CD3 فقط لاختيار خلايا T الحيوية.

تستبعد استراتيجية تحديد البوابات هذه العديد من الخلايا الميتة ولكن ليس جميعها، كما يظهر من خلال المجتمع المتبقي الصغير من الخلايا الميتة الموجبة لـ 7-AAD المتبقية في مخططات النقاط لـ CD3 مقابل 7-AAD. يمكن أن يؤدي اختيار الفلوروكرومات المستخدمة في التنميط المناعي إلى خلق مشكلات تعويض صعبة عند استخدام صبغات تتبع الخلايا، حيث تكون كثافة صبغ الخلايا غير المنقسمة ساطعة للغاية. في هذه التجربة، تم وسم الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي التي يبلغ عمرها 24 ساعة باستخدام PKH26، ثم صبغها صبغة مضادة باستخدام أجسام مضادة لـ CD3 وCD4 بالإضافة إلى صبغة حيوية.

في هذه السلسلة من البيانات، تم صبغ الخلايا المحددة بـ 2 µM من PKH 26 بصبغات مضادة وهي anti CD3 FITC و anti CD4 APC، ثم تم تحليلها باستخدام استراتيجية بوابات R1 + R2 ذاتها المستخدمة سابقاً. ونظراً لوجود تداخل طفيف لـ PKH 26 في قناة APC، فقد تم تمييز الأحداث الإيجابية والسلبية لـ CD4 بوضوح سواء تم تطبيق التعويض أم لا. وتوضح هذه البيانات كيف ظلت خلايا T الحيوية الإيجابية لـ CD3 و CD4 متميزة جيداً حتى عندما تم زيادة التركيز النهائي لـ PKH 26 إلى 4 µM. أما استخدام anti CD4 PerCP بالتزامن مع anti CD3 FITC و 2 µM من PKH 26 وصبغة الحيوية Draken 7-AM فقد أعطى نتائج أسوأ بكثير بسبب التداخل الكبير لـ PKH 26 في قناة PerCP.

لم يكن من الممكن التمييز بين الخلايا الموجبة والسالبة لـ CD four في البيانات غير المعوضة، وكان التمييز بينها محدوداً للغاية حتى بعد تطبيق التعويض. وقد أدى رفع التركيز النهائي لـ PKH 26 إلى أربعة micromolar إلى فقدان تام للقدرة على التمييز بين الأحداث الموجبة لـ CD four والأحداث السالبة لـ CD four حتى بعد تطبيق التعويض. لاحظ أن العينات التي تضمنت أو افتقرت إلى anti CD four لكل CP كانت متطابقة بشكل أساسي.

عند تحليل ملف تخفيف الصبغة باستخدام برنامج نمذجة القمم لتقدير تكرار الخلايا في أجيال البنات المتتالية، يمكن أن تكون مواضع و/أو عروض قمم البنات المتتالية ثابتة أو عائمة، وذلك بالنسبة لقيم القمة الأبوية. ويتم تقدير هذه القيم من مجموعة التحكم غير المحفزة.

على سبيل المثال، تم الحصول على ملف تعريف شدة PKH 26 هذا من مزرعة غير محفزة لمدة 96 ساعة من مستجيب متوسط، وقد استُخدم لتزويد معالج ملاءمة تكاثر mod fit بالتقدير الأول للموقع والعرض للقمة التي تمثل الخلايا الأبوية غير المنقسمة. يتطلب استخدام إعداد ثابت لموقع القمة أن يكون متوسط كل قمة جيلية مساوياً تماماً لنصف شدة الفلورة للقمة السابقة. أما إعداد الموقع العائم للقمة فيسمح للمواقع النهائية للقمم الجيلية بالتفاوت عن الشدات المتوقعة حسب الحاجة لتحقيق أفضل ملاءمة.

وبالمثل، يتطلب الضبط الثابت لعرض القمة أن يكون عرض كل قمة جيلية مماثلاً لعرض قمة العينة الأبوية أو عينة التحكم غير المحفزة. أما الضبط العائم لعرض القمة فيسمح بتغيير العروض النهائية بشكل مستقل حسب الحاجة للحصول على أفضل مطابقة في هذا الجدول. وتظهر نتائج تحليلات الأشكال السابقة لمتبرعين مختلفين لهذين المتبرعين حيث كانت القمم الجيلية المميزة واضحة.

تم الحصول على أفضل قيم لـ reduced chi square عندما سُمح لكل من موقع القمة والعرض بالتحرك بحرية؛ أما بالنسبة لملفات التكاثر التي لا تظهر فيها قمم جيلية متميزة، فيوصى باستخدام إعداد ثابت لموقع القمة. وتوضح هذه البيانات استخدام صبغتين للتتبع لمراقبة تواريخ تكاثر أنواع مختلفة من الخلايا المناعية بشكل منفصل في مقايسة كبت مناعي باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم وسم الخلايا التائية المؤثرة (T effector cells) الموضحة باللون الأخضر بـ CFSE، بينما تم وسم الخلايا التائية التنظيمية (T regulatory cells) الموضحة باللون الأزرق بـ cell view.

تم خلط مجموعات خلوية موسومة بصبغة Claret بنسب متفاوتة واستنباتها بوجود anti CD three وanti CD 28 وخلايا مساعدة مشععة لمدة 96 ساعة. بعد ذلك، تم حصاد الخلايا وصبغها بـ anti CD four وPE size seven وlive dead violet. هنا، تُعرض بيانات تمثيلية لنسبة treg إلى T effector تبلغ 0.25 إلى 1 بعد استبعاد الخلايا الموجبة لصبغة live dead violet.

تم تطبيق بوابة تشتت الضوء التي تشمل الخلايا اللمفاوية والأرومات، مع استبعاد التجمعات والحطام الخلوي، تلتها بوابة لتحديد الأحداث الإيجابية لـ CD4. سمح صبغ Cell View Claret بتمييز خلايا treg الحية بسهولة عن خلايا T effector الحية التي تضاعفت بشكل كبير، وبالتالي تم تحليل ملفات تكاثر CFSE DIM للخلايا T effector الإيجابية لـ CFSE وخلايا treg الإيجابية لـ Cell View Claret باستخدام برنامج ModFit Peak Modeling. تم تحليل ما يقرب من 25,000 حدث.

من بين هذه الخلايا، كانت 48% عبارة عن خلايا T effector حية و6% عبارة عن خلايا T regs حية، بينما كانت بقية الخلايا عبارة عن خلايا ميتة وخلايا مساعدة وحطام خلوي. وكان مؤشر التكاثر المحسوب، الذي يعكس مقدار الزيادة في عدد الخلايا خلال فترة المقايسة، 3.85 لخلايا T effectors و1.83 لخلايا Tregs. يوضح الشكل هنا تأثير تركيز خلايا tregs على مؤشر تكاثر خلايا T effector المحسوب من ملف تخفيف صبغة CFSE.

كانت النتائج متماثلة، سواء تم وسم خلايا treg بصبغة cell view claret أو تُرِكت دون صبغ، مما يشير إلى أن وظيفة خلايا treg لم تتأثر بعملية الصبغ. ومع التتبع، وكما كان متوقعاً، زاد مدى تكاثر خلايا tector مع انخفاض تركيز خلايا treg. كما تم حساب مؤشرات تكاثر خلايا Treg من خلال ملفات تخفيف صبغة cell view claret عند نسب مختلفة من خلايا treg إلى خلايا T effector.

كما كان متوقعاً، خضعت الخلايا التائية المنظمة (Tregs) لتكاثر أدنى في غياب الخلايا التائية المؤثرة مع زيادة تركيز الخلايا التائية المؤثرة. ومع ذلك، زاد أيضاً مدى تكاثر الخلايا التائية المنظمة. بعد مشاهدة الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام صبغات تتبع الخلايا بنجاح لمراقبة تكاثر الخلايا، وكيفية اختيار الفلوروكرومات المناسبة وعناصر التحكم في تعويض الألوان، وكيفية اختيار نموذج مناسب لقياس انقسام الخلايا بناءً على تخفيف الصبغة.

إلى جانب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى للإجابة على الأسئلة التجريبية، مثل صبغ الخلايا التائية النوعية للمستضد أو الفرز التدفقي لاستعادة الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية التي تكون في حالة سكون أو تنقسم ببطء. شكراً جزيلاً للمشاهدة.