الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

الهدف العام من هذه الطريقة هو استخدام أصباغ تتبع الخلايا لتحديد مدى انقسام الخلايا بشكل مباشر لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية داخل مجموعات سكانية معقدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات أولا على مجموعة الخلايا الأم بصبغة فلورية معروفة بأنها تعطي ارتباطا مستقرا للبروتينات الخلوية أو لإقحام غير تساهمية في الأغشية الخلوية لتتبع الخلايا ذات العلامات الصبغية التي تستجيب لعدادات التحفيز ، والتلوين بالأجسام المضادة الفلورية والتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات يسمح باكتشاف الاستجابات التفاضلية بين أنواع الخلايا المناعية التي يتم تحفيزها ، ولكن يتم استخدام عناصر التحكم غير الملوثة بصبغة التتبع لإنشاء أقل كثافة مضان للخلية الوليدة التي يمكن تمييزها عن صبغة تتبع التألق الذاتي المسماة ، ولكن يتم بعد ذلك استخدام عناصر التحكم غير المحفزة لتحديد شدة التألق التي سيتم عندها اكتشاف الخلايا غير المقسمة. ينتج عن التحفيز عادة مجموعة واسعة من الشدة حيث تصبح الخلايا التي تتكاثر استجابة باهتة بشكل تدريجي ، لكن غير المستجيبين لا يفعلون ذلك.

في النهاية ، يمكن أن يسمح استخدام برنامج نمذجة الذروة لتقدير التردد النسبي للخلايا في أجيال مختلفة بالمقارنة الكمية للاستجابات التكاثرية عبر مجموعات سكانية أو محفزات مختلفة باستخدام مقاييس مثل مؤشر الانتشار أو تردد السلائف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل tritiated أو دمجك أو تعبير KI 67 ، هي أن تخفيف DI يوفر مقياسا مباشرا لانقسام الخلايا الذي يمكن دمجه مع مقاييس قياس التدفق الخلوي الأخرى مثل التنميط المناعي وإنتاج السيتوكين. يعد العرض المرئي لطريقة تلطيخ صبغة الغشاء مفيدا لأن امتصاص الخلايا للصبغة سريع للغاية.

وبالتالي ، فإن التقنية الجيدة هي المفتاح للحصول على تلطيخ متجانس مشرق. بعد عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لتقليل تلوث الصفائح الدموية. ثم أعد تعليق الحبيبات عند 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر في HBSS بالإضافة إلى 1٪ BSA ، وضعها على الجليد.

قم بإزالة واحتفظ ب 500 ميكرولتر من Eloqua ، ثم انقل 500 ميكرولتر أخرى من الخلايا إلى أنبوب بولي بروبلين مخروطي 12 × 75 ملم. أضف 3.5 مل من HBSS وقم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 مرة G ودرجة حرارة الغرفة أثناء الغسيل ، أضف 0.5 مل من مركبة وضع العلامات C المخففة من مجموعة PKH 26 GL إلى أنبوب بولي بروبيلين مخروطي آخر مقاس 12 × 75 مليلتر ، واستنشق بعناية السوبر ناتين ، مع ترك ما لا يزيد عن 15 إلى 25 ميكرولتر من السوائل المتبقية ، مع الحرص على عدم إزالة أي خلايا. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من مركبة وضع العلامات المخففة C إلى حبيبات الخلية وشفط المحلول ووزعه عدة مرات للحصول على تعليق خلية واحدة.

الآن قم بإعداد مخزوني XD عن طريق إضافة ميكرولترين من PKH 26 إلى الأنبوب الذي يحتوي على مخفف C. الآن فقط قم بسحب تعليق الخلية على الفور في محلول صبغة XPKH 26 المحضر حديثا وشفط الخليط وتوزيعه في نفس الوقت عدة مرات لتفريق الخلايا بشكل موحد في جميع أنحاء الصبغة. بعد دقيقة واحدة ، أضف ملليلترا واحدا من المصل المعطل بالحرارة لوقف امتصاص الصبغة في أغشية الخلايا. بعد الدوران لأسفل ، قم بشفط الخلايا بعناية دون إزالة الحبيبات.

ثم قم بتفريق الحبيبات في أربعة ملليلتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على 10٪ مصل معطل للحرارة ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب بولي بروبلين جديد. اغسل الخلايا مرتين في HBSS بالإضافة إلى 1٪ BSA ستظهر الخلايا الملطخة بشكل كاف مسحة وردية مميزة في الحبيبات بعد إعادة تعليق بيليه الخلية في مليلتر واحد HBSS بالإضافة إلى 1٪ BSA ، عد الخلايا ثم اضبط الحجم لإعطاء تركيز نهائي من 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر. بعد تلطيخ الخلايا وفقا لبروتوكول قياس التدفق الخلوي الموضح في الجدول ، استخدم الأنابيب الخمسة الأولى لضبط معلمات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي والإشارات في جميع أجهزة الكشف الفلورية الأربعة.

على وجه الخصوص للكاشف المستخدم لمراقبة مضان PKH 26 في الأنبوب الثاني. تحقق من ظهور جميع الخلايا الملطخة PKH 26 على المقياس كذروة متناظرة واحدة في العقد الثالث إلى الرابع مع وجود عدد قليل من الخلايا أو عدم وجودها في القناة الأخيرة. بعد ذلك ، استخدم برنامج تعويض الألوان وملفات وضع القائمة التي تم جمعها للأنابيب من واحد إلى خمسة لإنشاء مصفوفة تداخل لوني لكل فلورو في أجهزة الكشف المستخدمة لمراقبة الفلوروكرومات الثلاثة الأخرى.

ثم قم بتطبيق هذه المصفوفة على ملف وضع القائمة للعينة الستة. للتحقق من أن وجود وضع العلامات PKH 26 لا يغير القدرة على اكتشاف سبع خلايا موجبة A و D. الآن قم بتطبيق مصفوفة تداخل الألوان التي تم إنشاؤها للتو على ملف وضع القائمة للأنبوب السابع.

حدد القرص المضغوط ، وثلاثة ، وثلاثة ، وأربعة ، وأربعة ، وثلاثة ، وأقراص مضغوطة موجبة ، وأربعة مجموعات موجبة على مخطط FE مقابل مخطط PC. تأكد من أن وجود جهاز كمبيوتر مضاد للقرص المضغوط ثلاثة و FE ومضاد للقرص المضغوط أربعة A لا يغير القدرة على اكتشاف سبع خلايا إيجابية A و D. أخيرا ، قم بتطبيق مصفوفة تداخل الألوان للأنبوب السابع على وضع القائمة ملف للأنبوب الثامن.

الآن افتح برنامجا يحتوي على وحدة تحليل الانتشار. قم بتحميل ملف PKH 26 الملون المحفز من مجموعة البيانات المراد تحليلها. بعد ذلك ، حدد معلمات التحليل في هذه الحالة ، PKH 26 مسور على قرص مضغوط سالب سبعة قابلة للحياة ، وثلاثة خلايا ليمفاوية موجبة ومبعثر أمامي مقابل تشتت جانبي لاستبعاد الحطام الصغير والركام الكبير.

عند تحديد هذه المناطق ، احرص على تضمين منطقة التشتت الأمامية العالية حيث توجد الانفجارات عادة. بعد ذلك ، افتح معالج الانتشار. انقر فوق علامة التبويب "ابدأ" لفتح ملف البيانات ثم قم بتحميل عنصر التحكم الإيجابي PKH 26 غير المحفز.

تحديد موقع الذروة الأبوية المقابلة للخلايا غير المقسمة. قم بتحليل الملف مع ملاحظة قيم موضع الذروة والوالدين وعرضها. إذا كان عرض الذروة الثابت مطلوبا ، فتحقق من قفل SD وقم بتحميل عنصر التحكم السلبي P KH 26 واضبط عدد الأجيال عن طريق ضبط قناة الذروة لجيل ابنة dimus فوق الخلايا السالبة PKH 26.

هذا يحدد عدد أجيال الابنة. يمكن أن يتناسب النموذج بدقة عند اكتماله. أعد تحميل ملف PKH 26 الإيجابي المحفز.

إذا كانت قمم الأجيال المميزة واضحة ، فاختر الإعداد العائم ضمن خيار النموذج. إذا لم تكن عقود السجل 4.0 بالضبط ، فاضبط تباعد الأجيال كما تمت مناقشته في المقالة. الآن ، قم بتحليل العينة المحفزة وتأكد من أن منطقة موضع الذروة الأبوية تظل دون تغيير.

أخيرا ، حدد تحليل لكل ملف تجريبي في مجموعة البيانات لتطبيقه. قام النموذج للتو بإنشاء وتسجيل مقاييس الانتشار المطلوبة الناتجة عن الأنسب لكل ملف تجريبي في مجموعة البيانات. توضح هذه السلسلة الأولى من البيانات تأثير تقنية الخلط على توزيعات مضان PKH 26.

عند استزراعها ، تم تلطيخ الخلايا النخاعية U 9 37 بصبغة تتبع الخلية باستخدام الطريقة الموصوفة للتو ، يظهر هذا الرسم البياني الأول بيانات التحكم غير الملوثة. تم تعديل إعدادات مقياس الخلوي لوضع التألق الذاتي من هذه الخلايا في العقد الأول مع عدم تراكم الخلايا أو تراكم عدد قليل جدا منها في القناة الأولى. يوضح هذا الرسم البياني الثاني تلطيخا جيدا ل PKH 26.

أعطى الخلط السريع لخليتين x مع صبغتين x توزيعا مضنوعا كان ساطعا ومتجانسة ومتماثلا ، ولكن لم يكن له خلايا خارج النطاق في إعدادات الأداة المستخدمة في الرسم البياني السابق. عندما تمت إضافة خليتين x إلى صبغتين x دون خلط فوري ، تم الحصول على توزيع مضان غير متجانس. سيتم تفسير هذه المجموعة الفرعية الصغيرة من الخلايا ذات العلامات الخافتة بشكل خافت بشكل خاطئ على أنها خلايا ابنة إذا كانت موجودة في وقت لاحق في الرسم البياني النهائي من هذه التجربة ، وحدث الخلط السيئ أيضا عندما تمت إضافة ثلاثة ميكرولترات من مخزون صبغة الإيثانول المركز عن طريق الخطأ مباشرة إلى 0.5 مل من تعليق خليتين x مما أدى إلى توزيع شدة مضان خافت للغاية ومنحرف بشكل صحيح.

هنا نتائج نموذجية من تجربة الانتشار التي تم فيها زراعة خلايا الدم المحيطي البشرية الملطخة PKH 20 مع أو بدون محفز. يتم عرض كواشف Anti CD Three و IL. بعد 96 ساعة من الثقافة ، تم حصاد الخلايا ومضادة للبقع باستخدام مضاد للقرص المضغوط ثلاثة FE مضاد للقرص المضغوط 19 A PC وسبعة A a d.

تمت مقارنة استراتيجيتين مختلفتين للبوابات في استراتيجية البوابات الأولى ، مخطط نقطي من القرص المضغوط ثلاثة مقابل سبعة. تم استخدام A A D لتحديد سبعة خلايا CD سلبية حية وثلاث خلايا تائية موجبة. ثم تم استخدام منطقة مبعثر أمامية وجانبية لإخراج الركام الكبير مع الاستمرار في تضمين الخلايا الليمفاوية المتفجرة.

تمثيل R واحد زائد R اثنين من الأحداث المسورة للتحكم غير الملوثة بالرسم البياني الرمادي و PKH 26 الملون ، ولكن الخلايا غير المحفزة باللون الأزرق ، وهي تلطيخ متجانس متماثل مشرق للخلايا التائية القابلة للحياة ولكن غير المقسمة في التحكم غير المحفز. تم إبوابات هذه البيانات بنفس طريقة الشكل السابق ، ولكن في هذه الحالة ، تم تحفيز الخلايا باستخدام مضاد للقرص المضغوط الثالث و IL اثنين. يحتوي الرسم البياني PKH 26 ل R واحد بالإضافة إلى R اثنين من الأحداث المسورة الآن على خلايا مقسمة في الغالب بكثافة منخفضة ممثلة بقمم ملونة لكل جيل ابنة.

على الرغم من أن بعض الخلايا الساطعة غير المقسمة لا تزال في ذروة الوالدين الزرقاء. لاحظ أن شدة الخلايا المنقسمة للغاية لا تتداخل بعد مع المنطقة التي يتم فيها قياس الخلايا غير الملوثة ، مما قد يربك تقدير المقاييس بناء على عدد الخلايا في أجيال الابنة الأقل كثافة هنا. تم تحليل نفس البيانات مثل المجموعتين السابقتين من الأشكال ، ولكن تم استخدام التشتت الخفيف والقرص المضغوط الثالث فقط لاختيار الخلايا التائية القابلة للحياة.

تستبعد استراتيجية البوابات هذه العديد من الخلايا الميتة ، ولكن ليس كلها كما يتضح من السكان المتبقيين الصغيرين المكون من سبع خلايا ميتة إيجابية A و D المتبقية في القرص المضغوط ثلاثة مقابل سبعة مخططات نقطية A A. يمكن أن يؤدي اختيار الفلوروكرومات المستخدمة في التنميط المناعي إلى حدوث مشكلات تعويض صعبة عند استخدام قوالب تتبع الخلايا لأن شدة تلطيخ الخلايا غير المقسمة مشرقة للغاية. في هذه التجربة ، تم تصنيف خلايا الدم المحيطية أحادية النواة البالغة من العمر 24 ساعة ب PKH 26 ثم تم وضع صبغة مضادة بالأجسام المضادة للقرص المضغوط الثالث والقرص المضغوط الرابع بالإضافة إلى صبغة البقاء.

في هذه السلسلة من البيانات ، كانت الخلايا المصنفة باثنين من micromolar PKH 26 عبارة عن صبغة مضادة مع مضاد للقرص المضغوط ثلاثة FZ سبعة A a D ، ومضاد للقرص المضغوط أربعة A PC ، ثم تم تحليلها باستخدام نفس استراتيجية البوابة R واحد بالإضافة إلى R اثنين كما كان من قبل ، لأن هناك تداخلا ضئيلا ل PKH 26 في قناة A PC ، تم حل أربعة أحداث إيجابية وسلبية بوضوح سواء تم تطبيق التعويض أم لا. توضح هذه البيانات كيف ظلت خلايا CD الصالحة للحياة ، وثلاث خلايا CD إيجابية ، وأربع خلايا تائية إيجابية ، حلولة بشكل جيد حتى عندما زاد تركيز PKH 26 النهائي إلى أربعة ميكرومولار. أعطى استخدام مضاد القرص المضغوط أربعة لكل CP بالاشتراك مع مضاد CD ثلاثة FE اثنين من micromolar PKH 26 وقالب الجدوى إلى pro three نتائج أسوأ بكثير بسبب التداخل الكبير ل PKH 26 في قناة CP لكل قناة CP.

تعذر حل أربع خلايا موجبة وسالبة من بعضها البعض في البيانات غير المعوضة ولم يتم حلها بشكل هامشي إلا عند تطبيق التعويض. أدت زيادة تركيز PKH 26 النهائي إلى أربعة ميكرومولار إلى فقدان كامل للقدرة على حل القرص المضغوط الرابع الإيجابي من أربعة أحداث سلبية حتى بعد تطبيق التعويض. لاحظ كيف أن العينات بما في ذلك أو تفتقر إلى مضاد CD أربعة لكل CP كانت متطابقة بشكل أساسي.

عندما يتم تحليل ملف تعريف تخفيف الصبغة باستخدام برنامج نمذجة الذروة لتقدير تواتر الخلايا في الأجيال الابنة المتعاقبة ، يمكن تثبيت مواضع و / أو عرض قمم الابنة المتتالية أو تعويمها. فيما يتعلق بقيم الذروة الأبوية. يتم تقدير هذه القيم من التحكم غير المحفز.

على سبيل المثال ، ملف تعريف شدة PKH 26 هذا من ثقافة 96 ساعة غير محفزة من مستجيب معتدل وتم استخدامه لتزويد معالج انتشار التعديل مع التقدير الأول للموضع والعرض للذروة التي تمثل الخلايا الأبوية غير المقسمة. يتطلب استخدام إعداد ثابت لموضع الذروة أن يكون متوسط كل ذروة جيال نصف شدة التألق بالضبط للذروة السابقة. يسمح إعداد الطفو لموضع الذروة باختلاف المواضع النهائية لقمم الأجيال عن الشدة المتوقعة حسب الحاجة للحصول على أفضل ملاءمة.

وبالمثل ، يتطلب الإعداد الثابت لعرض الذروة أن يكون عرض كل ذروة جيل هو نفسه عرض ذروة التحكم الأبوية أو غير المحفزة. يسمح إعداد التعويم لعرض الذروة بتغيير العروض النهائية بشكل مستقل حسب الحاجة للحصول على أفضل ملاءمة في هذا الجدول. تظهر نتائج تحليلات الأرقام السابقة لمتبرعين مختلفين لهؤلاء المتبرعين حيث كانت ذروة الأجيال واضحة بشكل واضح.

تم الحصول على أفضل قيم مربع كاي المخفضة عندما سمح لكل من موضع الذروة والعرض بالطفو لملامح الانتشار حيث لا تكون قمم الأجيال المميزة واضحة ، يوصى بإعداد ثابت لموضع الذروة. توضح هذه البيانات استخدام صبغتين للتتبع لمراقبة تاريخ الانتشار لأنواع مختلفة من الخلايا المناعية بشكل منفصل في مقايسة قمع المناعة لقياس التدفق الخلوي. تم تصنيف الخلايا المستجيبة التائية الموضحة باللون الأخضر بالخلايا التنظيمية CFSE و T الموضحة باللون الأزرق مع عرض الخلية.

تم خلط مجموعات الخلايا المسماة ب Claret بنسب متفاوتة وزراعتها في وجود خلايا ملحقة مضادة للقرص المضغوط ثلاثة ، ومضادة للقرص المضغوط 28 ، وخلايا ملحقة مشعة لمدة 96 ساعة. بعد ذلك ، تم حصاد الخلايا وتلطيخها بمضادات القرص المضغوط أربعة ، وحجم PE سبعة والبنفسج الميت الحي. هنا. يتم عرض البيانات التمثيلية لنسبة مستجيب treg إلى T من 0.25 إلى واحد بعد إخراج الخلايا الحية الموجبة البنفسجية الميتة.

تم تطبيق بوابة مبعثرة خفيفة تضمنت الخلايا الليمفاوية والانفجارات ، ولكنها استبعدت الركام والحطام ، تليها بوابة لتشمل القرص المضغوط أربعة أحداث إيجابية. سمح تلطيخ كلاريت لعرض الخلية بتمييز خلايا Treg القابلة للحياة بسهولة عن خلايا المستجيب T القابلة للحياة التي تكاثرت بشكل كبير ، وبالتالي تم تحليل ملامح انتشار CFSE DIM لخلايا المستجيب T الإيجابية CFSE وخلايا Treg الإيجابية لعرض الخلية باستخدام برنامج نمذجة الذروة mod fit. تم تحليل ما يقرب من 25,000 حدث.

من بين هؤلاء ، 48٪ كانت مؤثرات T قابلة للحياة ، 6٪ كانت T regs قابلة للحياة والباقي عبارة عن خلايا ميتة وخلايا ملحقة وحطام. كان مؤشر الانتشار المحسوب ، الذي يعكس زيادة الطية في عدد الخلايا خلال فترة الفحص ، 3.85 للمؤثرات T و 1.83 ل Tregs. هنا ، يظهر تأثير تركيز خلية Tregs على مؤشر تكاثر الخلايا المستجيبة التائية المحسوبة من ملف تعريف تخفيف صبغة CFSE.

كانت النتائج هي نفسها ، سواء تم تصنيف خلايا Treg بعرض الخلية أو تركت غير ملوثة مما يشير إلى أن وظيفة Treg لم تتغير عن طريق التلوين. مع التتبع كما هو متوقع ، زاد مدى انتشار tector مع انخفاض تركيز خلايا Treg. تم حساب مؤشرات تكاثر خلايا Treg أيضا من ملامح تخفيف صبغة كلاريت لعرض الخلية بنسب مستجيب مختلفة من Treg إلى T.

كما هو متوقع ، خضعت Tregs للحد الأدنى من الانتشار في غياب الخلايا المستجيبة التائية مع زيادة تركيز الخلايا المستجيبة التائية. ومع ذلك ، زاد أيضا مدى تكاثر الخلايا المضافة. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام أصباغ تتبع الخلايا بنجاح لمراقبة تكاثر الخلايا ، وكيفية اختيار الفلوروكروم المناسب وعناصر التحكم في تعويض اللون ، وكيفية اختيار نموذج مناسب لقياس انقسام الخلايا بناء على تخفيف الصبغة.

إلى جانب هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى للإجابة على الأسئلة التجريبية مثل تلطيخ الخلايا التائية الخاصة بالمستضد أو فرز التدفق لاستعادة الخلايا الشبيهة بالجذع الهادئة أو المنقسمة ببطء. شكرا جزيلا على المشاهدة.