انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى
November 26th, 2008
وقد تجلى هناك طريقة بسيطة ومحددة لوضع العلامات الفلورسنت وتعزيز اكتشاف بروتينات سطح الخلية دون خطوة التجزئة. وتم تحليل وفرة الفرق في البروتينات سطح الخلية باستخدام الكهربائي ثنائي الأبعاد (2 - D) وEttan التكنولوجيا DIGE ™.
اسمي ماريا وأعمل في Y Healthcare في NOS في السويد. غالبا ما تشارك بروتينات سطح الخلية في التواصل بين الخلايا وبيئتها ، وبالتالي فهي مهتمة بشكل خاص بالبحث ، بهدف اكتساب مزيد من التبصر للأمراض بالإضافة إلى الاختلافات البيولوجية الأخرى التي تسببها التغيرات في بيئة الخلية. في هذا الفيديو ، سأعرض لك بروتوكولا بسيطا لوضع العلامات على سطح الخلية المراوغة بالعين الجانبية وستكون قادرا على إثراء هذه البروتينات منخفضة الوفرة بصريا دون تحسين فيزيائي ودراسة الاختلافات بين بروتينات سطح الخلية هذه باستخدام التكنولوجيا.
إذا وجدت هذه التقنية مثيرة للاهتمام ، فيمكنك العثور على مزيد من المعلومات في الكتيب ثنائي الأبعاد. علاوة على ذلك ، لدينا ملاحظة تطبيق حول هذا الموضوع المعين والتي يمكنك تنزيلها من الوظيفة في بروتوكول وضع العلامات على سطح الخلية المرئي في الأعلى ، يمكنك تسمية الخلايا وهي لا تزال سليمة. أثناء عملية وضع العلامات ، لن تتمكن الصبغة إلا من الوصول إلى بروتينات سطح الخلية.
بعد خطوة التسمية ، يتم تحليل الخلايا للتحقق من التسمية الخاصة بسطح الخلية. تم تقسيم عينة الملصق إلى بروتينات غشائية وعصارية خلوية. تم تحضير عينة غير مجزأة بالتوازي.
للمقارنة ، فإن تحليل التجزئة هذا ليس ضروريا ، ولكن تم إجراؤه هنا فقط لإظهار أن بروتوكول سطح الخلية خاص بالنصائح الاحترافية لسطح الخلية. لقد أجرينا أيضا بروتوكول وضع العلامات غير الغذائية ETH القياسي الذي يظهر أدناه عبارة عن أكاذيب قبل وضع العلامات ، وبهذه الطريقة يمكن الوصول إلى جميع البروتينات الخلوية لوضع العلامات. بعد خطوة وضع العلامات ، تخضع العينات للرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد.
يتم فصل الخلايا الملتصقة باستخدام إجراء غير إنزيمي لتجنب هضم بروتينات سطح الخلية المستهدفة. في هذا البروتوكول ، نستخدم شرطي المطاط ، ولكن استخدام وسائط تفكك الإنزيم ثلاثية الخلايا هو أيضا عدد خيارات وتقسيم معلقات الخلية إلى خمسة إلى 10 ملايين خلية لكل أنبوب. ثم يتم تكوير الخلايا وغسلها في H-P-S-S-P-H 7.4 لإزالة آثار زراعة الخلايا.
يمكن أن يتداخل تلوث الوسائط من بروتينات المصل ومكونات الفلورسنت مع وضع العلامات والكشف. يتم تكوير الخلايا التي تنمو في المعلق مباشرة وغسلها قبل خطوة وضع العلامات بعد الغسيل. يتم تعليق لوحة الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات على الجليد يحتوي على درجة الحموضة HPSS 8.5 وبوال مولي واحد.
للحصول على ظروف وضع العلامات المثلى لبروتينات سطح الخلية ، تحقق دائما من درجة الحموضة. قبل وضع العلامات ، استخدمنا 600 عين جانبية من قالب الموافقة المسبقة عن علم ل 10 ملايين خلية CHO. تختلف النسبة المثلى للعين الجانبية إلى عدد الخلية حسب نوع الخلية.
لأننا لا نعرف تركيزات البروتين الدقيقة على سطح الخلية. يتم وصف كيفية تحديد الظروف المثلى لوضع العلامات الجانبية على البروتينات في كتيب مبادئ وطرق الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد. يتم تحضين الخلايا بأرضية جانبية للعين D ، والحد الأدنى من النرد لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
بعد تفاعل الملصقات ، يتم إخماد الصبغة غير التفاعلية بإضافة 20 ميكرولتر من 10 مللي مولار ليسين. يتم الآن غسل خلايا الملصق مرتين في محلول HPSS البارد pH 7.4 لإزالة العين الجانبية الزائدة. لذلك لن تكون هناك صبغة مجانية متبقية لوضع العلامات أو البروتينات داخل الخلايا غير المرغوب فيها في الخطوة التالية ، وهي تحلل الخلايا.
يتم الآن تصنيف البروتينات الموجودة على سطح الخلية ويتم غسل الخلايا وتكون جاهزة للرشح. يتم تعليق الحبيبات من خطوة الغسيل المفقودة في 150 ميكرولتر مخزن مؤقت للتحلل البارد يحتوي على سبعة بوال مولي ، واثنين من التبال المولار ، و 4٪ فصول 30 ملي مولار من الأشجار ، وخمسة مللي مولار من أسيتات المغنيسيوم ، ودرجة الحموضة 8.5 وتترك على الجليد لمدة ساعة واحدة على الأقل مع فرض ضرائب دوامة عرضية. العينات جاهزة الآن للفصل ثنائي الأبعاد.
الخطوة الأولى في التحليل الكهربائي هي تحضير شرائط IPD للترطيب. قم بإعداد محلول معالجة الجفاف عن طريق إضافة محلول IPG المقابل لفاصل الأس الهيدروجيني للشرائط المستخدمة ، وأضف المحلول في عدسة صينية الإماهة. قم بإزالة الطبقة الواقية لشريط IPG وضع الشرائط بعناية مع وجود جل مجفف متجها لأسفل في صينية إعادة الجفاف التي تحتوي على محلول إعادة الترطيب.
أغلق غطاء صندوق IPG وأعد ترطيب الشرائط طوال الليل. في البعد الأول ، التركيز متساوي الكهرباء ، يتم فصل البروتينات وفقا ل pi. يتم تنفيذ ذلك باستخدام IPG أربعة ثلاثة.
يتم وضع الشرائط المعاد ترطيبها في المشعب ويتم تثبيت القطب في الأعلى. تم تطبيق 50 ميكروغراما من كل عينة باستخدام أغطية تطبيق العينة. لقد قمنا إما بتطبيق عينات غير مجزأة مباشرة دون تجزئة مسبقة أو قمنا بتجزئة العينات إلى كسور غشائية وعصارية خلوية قبل تطبيقها.
يتمإغلاق الرصاص لحماية عينات الفلورسنت من الضوء. تمت برمجة الأداة وفقا للتوصية وتشغيلها بين عشية وضحاها. تم تكلفة المواد الهلامية الكبيرة بنسبة 12٪ باستخدام هلام 12 للبالغين.
تمت إضافة محلول إزاحة Coster لتجنب المواد الهلامية المبلمرة في الأنابيب. سمح للمواد الهلامية بالبلمرة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بعد التركيز المتساوي الكهربي ، تتم إزالة الشرائط وتوازنها في SDS التي تحتوي على مخزن مؤقت في خطوتين باستخدام DTT لتقليل روابط ثنائي الكبريتيد لبقايا السيستين متبوعة بالألكلة مع الأسيتاميد لتجنب التعديل بواسطة مادة الأكريلاميد.
يتم غمس شرائط IPG في المخزن المؤقت للتشغيل وتوضع بعناية فوق جل الحفر الكبيرين. تجنب حبس الهواء بين الشرائط والهلام المغلق عن طريق إضافة محلول زراعي ذائب بنسبة 2٪ مع برومو أنول أزرق في الأعلى. المواد الهلامية جاهزة الآن لفصل صفحة SDS للبعد الثاني في صفحة SDS للبعد الثاني.
سيتم فصل البروتينات وفقا للوزن الجزيئي ويتم تنفيذ ذلك باستخدام نظام الدرجة المئوية السادسة. املأ غرفة الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت للتشغيل الأنودي ، وأدخل المواد الهلامية واملأ المقصورة العلوية ببرنامج عازلة للتشغيل الكاثودي. مصدر الطاقة وفقا للتوصيات وتشغيل البعد الثاني المحمي من الضوء لمدة أربع إلى خمس ساعات تقريبا أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل.
بعد الرحلان الكهربائي للبعد الثاني ، يتم وضع أشرطة الجل باستخدام القابضين في جهاز تصوير الفلورسنت الإعصاري. يمكن مسح اثنين من المواد الهلامية وثلاث قنوات في وقت واحد. تظهر النتيجة من هذين DL دقة عالية لبروتينات الغشاء في العينة ، حتى لو كانت هناك بعض القيود المعروفة للبروتينات الكارهة للماء التي سيتم اكتشافها في A two DL ، تظهر النتائج العديد من بقع تسمية سطح الخلية الجديدة الموضحة هنا باللون الأحمر والتي لم يتم اكتشافها باستخدام بروتوكول الملصقات القياسي الموضح هنا باللون الأخضر.
تظهر هذه النتائج أن بروتوكول وضع العلامات على سطح الخلية محدد للغاية لوضع العلامات على بروتينات سطح الخلية. نظرا لأن بروتينات سطح الخلية مصنفة حصريا ، فمن السهل تصورها وتجنب التوهين بواسطة بروتينات العصارة الخلوية الوفيرة. تظهر الصورة الفلورية للمواد الهلامية ذات الكسر الغشائي غير المجزأ أو الكسر العصاري الخلوي في الأعلى.
يوجد أدناه صورة لنفس بقعة ما بعد الجل بالفضة. تظهر النتائج عدم وجود ملصقات فلورية للبروتينات العصارية الخلوية ، لكن تلطيخ الفضة يظهر وجود بروتينات في المواد الهلامية. تظهر النتائج أيضا أنماط خريطة موضعية متشابهة من الكسور غير المجزأة والغشائية مما يدل على عدم وجود حاجة للتجزئة قبل الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد ، مما يجعل هذا البروتوكول بسيطا ومريحا.
يظهر SI two و SI three و SCI five أنماط وضع العلامات المتشابهة وكلها متوافقة مع بروتوكول سطح الخلايا. تم إجراء تجربة نظام غذائي باستخدام جميع أرضية العين الجانبية الثلاثة DI الحد الأدنى لدراسة التعبير التفاضلي لبروتينات سطح الخلية في خلايا CHO من تجويع المصل لفترات زمنية مختلفة. تم تجميع عينتين من سطح الخلية CY من جميع العينات في التجربة واستخدامها كمعيار داخلي.
يمكن متابعة التغييرات التفاضلية للعديد من بروتينات سطح الخلية خلال فترة الجوع. تم اكتشاف أكثر من 18 بروتين غشائي جديد باستخدام بروتوكول سطح الخلية الذي لم يتم اكتشافه باستخدام البروتوكول القياسي للعثور على هوية البروتينات في الهلام التحضيري. كان من الضروري الارتفاع مع عينة سطح الخلية لتسهيل المطابقة مرة أخرى مع البقع الموجودة في مجموعة البيانات التحليلية.
هناك نتائج. تظهر النتائج دقة عالية لعدد كبير من بروتينات سطح الخلية. هذا البروتوكول محدد جدا لبروتينات سطح الخلية ولم يلاحظ أي وضع علامات على البروتينات داخل الخلايا.
باستخدام هذه الطريقة ، يمكنك اكتشاف المزيد من بروتين سطح الخلية مقارنة بالبروتوكول القياسي ، وكما رأيت بالفعل ، إنه بروتوكول بسيط للغاية للتشغيل. يمكنك ببساطة تسمية بروتينات سطح الخلية الخاصة بك وهي لا تزال سليمة وتشغيلها مباشرة على الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد دون تجزئة الغشاء. لذلك هذا بروتوكول جيد جدا لدراسة بروتينات سطح الخلية والاختلافات بين تلك التي تحتوي على تقنية D.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة طريقة بسيطة لوضع علامات فلورية على بروتينات سطح الخلية، مما يعزز كشفها دون الفصل. تعتمد الدراسة على الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد وتقنية Ettan™ DIGE لتحليل الوفرة التفاضلية لهذه البروتينات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- تحليل البروتين
- تقنيات وضع العلامات الفلورية
الخلفية
- تلعب بروتينات سطح الخلية دورًا مهمًا في التواصل الخلوي.
- فهم هذه البروتينات يمكن أن يوفر رؤى حول أمراض مختلفة.
- البروتينات قليلة الوفرة غالبًا ما تكون صعبة الدراسة بسبب وجودها الخفيف.
- تهدف هذه الدراسة إلى تحسين كشف وتحليل هذه البروتينات.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول وضع العلامات الذي يثري بروتينات سطح الخلية قليلة الوفرة.
- تسهيل دراسة الاختلافات في بروتينات سطح الخلية.
- توفير طريقة لا تتطلب تعزيزًا ماديًا للعينات.
الطرق المستخدمة
- وضع العلامات الفلورية على الخلايا السليمة.
- الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد لفصل البروتينات.
- تقنية Ettan™ DIGE لكشف محسّن.
- تحليل الوفرة التفاضلية في بروتينات سطح الخلية.
النتائج الرئيسية
- وضع علامات ناجح لبروتين سطح الخلية بدون فصل.
- كشف محسّن للبروتين قليلة الوفرة.
- تبين الاختلافات في وفرة البروتين باستخدام الطريقة المطورة.
- توفير بروتوكول موثوق لتطبيقات البحث في المستقبل.
الاستنتاجات
- تتيح الطريقة دراسة فعالة لبروتين سطح الخلية.
- تفتح مسارات جديدة للبحث في التواصل الخلوي وآليات المرض.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذا البروتوكول لمزيد من الرؤى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes enables high-specificity detection of low-abundance membrane proteins critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This protocol supports multiplexed, quantitative analysis of protein expression changes, directly informing predictive confidence at key inflection points in the biopharma pipeline. The approach streamlines workflows by eliminating the need for fractionation, enhancing reproducibility and scalability for enterprise R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell-surface protein dynamics relevant to disease and drug response.
- Supports functional target validation by isolating membrane protein changes under defined conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing surface from intracellular protein alterations.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, specifically labeled cell systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, multiplexed outputs using 2-D DIGE and DeCyder analysis software.
- Enables assay standardization and reproducibility by minimizing sample preparation variability.
- Supports reliable compound evaluation by focusing on surface-accessible targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by tracking cell-surface protein changes during environmental or treatment perturbations.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust biomarker detection.
- Reduces translational risk by supporting quantitative, statistically validated protein expression analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and quantitative screening readiness.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cell-surface protein involvement in signaling and adaptation.
- Screening: Provides reproducible, multiplexed assay outputs for comparative analysis.
- Analytics: Delivers quantitative, statistically supported measurements for differential protein expression.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by tracking surface protein changes under disease-relevant conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by eliminating fractionation and enabling multiplexed analysis.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent labeling and 2-D electrophoresis techniques.
- Needs access to compatible imaging and analysis platforms such as Ettan DIGE and DeCyder software.
- Demands cross-team standardization of labeling and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types with optimization of dye-to-cell ratios and labeling conditions.
- Limited by detection of highly hydrophobic or very high molecular weight proteins, as noted in source data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:10
Introduction to Cell Surface Protein Labeling with Ettan DIGE System
1:12
Overview of the Experiment
2:19
Sample Preparation
3:13
Labeling with CyDye DIGE Fluors
4:03
Incubation and Quenching
4:45
Cell Lysis
6:31
First Dimension ISO-Electric Focusing
5:29
Rehydration of IPG Strips
7:27
Gel Casting
9:43
Second Dimension SDS-Page
7:55
Equilibration of IPG Strips
10:29
Gel Scanning
10:52
Results of Cell Surface Protein Labeling
11:21
Comparison with Fractionated Runs
12:30
2D DIGE Analysis
13:27
Conclusions
