مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي

الهدف العام من هذا العرض التوضيحي هو المقارنة بين ثلاثة مقاييس مختلفة لتكاثر الخلايا وعرض مزايا وعيوب كل طريقة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أبحاث السرطان، مثل تحديد طريقة قياس تكاثر الخلايا الأكثر ملاءمة. ويُعد التحضير لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، نظراً لصعوبة تعلم خطوات التصوير الخلوي.

يتطلب الأمر منك التركيز على الخلايا قبل تطبيق قناع عد الخلايا المناسب. لبدء هذا الإجراء، قم بتنمية خطين خلويين من MCF-7 لمدة ثلاثة أيام حتى تصل درجة التلاقي إلى 75 إلى 80% في دوارق زراعة الأنسجة المربعة بحجم T75 سنتيمتر مربع باستخدام وسط DMEM خالٍ من الفينول الأحمر. بعد ثلاثة أيام، قم بإزالة الخلايا من الدوارق عن طريق سكب الوسط في حاوية النفايات.

بعد ذلك، اغسل طبقة الخلايا فوراً بـ 2 mL من التريبسين بتركيز ضعفين والمدفأ مسبقاً. اسحب التريبسين، وأضف 2 mL أخرى من التريبسين المدفأ مسبقاً إلى طبقة الخلايا قبل وضعها في الحاضنة. وبمجرد انفصال الخلايا، اغسلها بـ 10 mL من وسط DMEM المكمل والطازج والمدفأ.

بعد ذلك، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب معقم سعة 15 milliliter وقم بطرده مركزياً لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور خمس دقائق، اسحب الراشح بعناية وتخلص منه. بعد ذلك، أعد تعليق كتلة الخلايا في خمسة milliliters من وسط DMEM الطازج والمكمل.

لإجراء عد الخلايا، يتم تخفيف 100 µL من معلق الخلايا في 900 µL من 1× DPBS. بعد ذلك، ضع مستشعراً جديداً بقياس 60 µm على عداد الخلايا الآلي. اضغط باستمرار على المكبس واغمر المستشعر في معلق الخلايا المخفف.

قم بتحرير مكبس عداد الخلايا ببطء. بعد ذلك، قم بإزالة المستشعر من عداد الخلايا عند الانتهاء. ازرع الخلايا في حجم نهائي قدره 100 µL في طبق يحتوي على 96 عينًا بحيث تكون نسبة الالتحام حوالي 20% لإتاحة مساحة لنمو الخلايا وقياس التكاثر على مدار ثلاثة إلى خمسة أيام.

لتحديد عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، قم بتسخين كل من الوسط والتربسين مسبقاً إلى 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا، أو فرن، أو حمام مائي. بعد ذلك، اشفط الوسط من الخلايا وضعه في حاوية النفايات. ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 30 µL من الترببسين بتركيز ضعفين، واشفط الوسط إلى حاوية النفايات مرة أخرى.

بعد ذلك، اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام 30 µL من التريبسين بتركيز ضعفين، ثم حضنها لمدة خمس دقائق عند 37 °C. انقر بلطف على حافة الطبق لفصل الخلايا. لاحقاً، أضف 50 µL من وسط DMEM المكمل واخلط الخلايا عن طريق السحب والضخ بالممصّة حتى يتكون معلق خلوي أحادي.

ضع شريحة الغطاء الزجاجية فوق غرف العد وثبتها حتى تظهر حلقات حيود نيوتن بين حواف شريحة الغطاء والهيلوسيتوميتر. بعد ذلك، قم بسحب 20 µL من معلق الخلايا بواسطة الماصة بحذر تحت شريحة الغطاء واترك غرفة العد تمتلئ عن طريق الخاصية الشعرية. عقب ذلك، قم بفحص غرف العد في تخطيط الشبكة تحت تكبير 10x.

في هذا الإجراء، يتم إذابة كاشف التألق في حمام مائي عند درجة حرارة 22 °C لمدة 30 دقيقة. اقلب الزجاجة برفق للحصول على مزيج متجانس. بعد ذلك، قم بموازنة لوحة واحدة من الخلايا المستزراعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، أضف 100 µL من كاشف التلألؤ الحيوي إلى كل بئر. اخلط المحتويات على هزاز مداري لمدة دقيقتين. ثم، اترك اللوحة لتحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لإعداد تجربة لوميناج (luminescence) باستخدام برنامج قارئ الأطباق متعدد الأوضاع، قم بتشغيل قارئ الأطباق متعدد الأوضاع وافتح البرنامج. من مدير المهام (Task Manager)، اختر "التجارب" (Experiments) ثم "إنشاء جديد" (Create New). بعد ذلك، اختر "ملف" (File) من شريط الأدوات الجانبي، ومن تبويب "البروتوكول" (Protocol)، اختر "الإجراء" (Procedure).

بعد ذلك، اختر Greiner 96 flat bottom كنوع الطبق، وقم بتفعيل مربع Use Lid. اختر إجراء Read من قائمة Read method. ثم، اختر Luminescence كطريقة الكشف وانقر على OK. في مربع Read Step، حدد الآبار المراد مسحها من علامة التبويب Full Plate، وحدد الآبار التي ستعمل كآبار فارغة (blank wells).

اضبط مجموعة المرشحات (Filter Set) على "مرشح فارغ" (Empty Filter). اضبط الكسب (Gain) على 135، مع زمن تكامل (Integration Time) قدره 5 ثوانٍ لكل بئر، وارتفاع قراءة (Read Height) يبلغ 6.5 millimeters. انقر فوق "موافق" (OK) لحفظ إعدادات قراءة التألق الحيوي (luminescence read).

لإجراء قراءة التلألؤ البيولوجي، قم بإخراج حامل الأطباق عن طريق تحديد علامة تبويب Instrument Control والنقر على Plate Out. ضع الطبق المكون من 96 بئراً على حامل الأطباق، مع التأكد من إغلاق الغطاء. أغلق حامل الأطباق بالنقر على Plate In ضمن علامة تبويب Instrument Control.

بعد ذلك، انقر على Read Now في شريط الأدوات لإجراء قراءة لوميّانية. عقب ذلك، قم بتصدير قياسات RLU لكل بئر إلى جدول بيانات لإجراء مزيد من التحليل. ولإعداد تجربة تصوير خلوي، قم بتشغيل جهاز تصوير الخلايا متعدد الأنماط وافتح البرنامج.

في مدير المهام (Task Manager)، حدد علامة تبويب التجارب (Experiments) ثم اختر إنشاء جديد (Create New). ومن شريط أدوات الملف، انقر فوق علامة تبويب البروتوكول (Protocol) ثم علامة تبويب الإجراء (Procedure). حدد إجراء ضبط درجة الحرارة (Set Temperature).

قم بتشغيل الحاضنة (Incubator)، واضبط درجة الحرارة على 37 degrees Celsius. حدد خيار التسخين المسبق (Preheat)، ثم انقر فوق موافق (OK) لحفظ الإعدادات. بعد ذلك، اختر إجراء القراءة (Read).

انقر على Image كطريقة للكشف. ثم حدد نوع القراءة Endpoint/Kinetic ونوع البصريات Filters، وانقر على OK. بعد ذلك، انقر على علامة التبويب Full Plate، وحدد الآبار المراد تصويرها في الطبق. انقر على OK لحفظ الإعدادات.

الآن، اختر العدسة الشيئية 2.5x من القائمة المنسدلة لخيار Objectives. ومن علامة تبويب Channels، اختر GFP 469.525 و Bright Field. حدد خيار Auto Exposure لكلا القناتين، ثم اختر بئر التعريض الضوئي التلقائي.

لتحديد إعدادات التركيز التلقائي، انقر فوق "Options". ومن خيارات التركيز التلقائي، حدد الطريقة "Scan" ثم "auto focus". انقر فوق "OK" لحفظ الإعدادات.

بعد ذلك، قم بضبط الإزاحة الأفقية والرأسية عن مركز البئر على صفر. اختر مسح عدة صور لكل بئر في تجميعة مكونة من ثلاثة في اثنين. ثم انقر فوق OK لحفظ إعدادات الإجراء.

لقراءة التجربة على الصفيحة المختارة، انقر فوق علامة تبويب Instrument Control واختر وظيفة Plate Out. ضع صفيحة ذات 96 بئراً على حامل الصفائح، مع التأكد من إغلاق الغطاء. وتحت علامة تبويب Instrument Control، اختر وظيفة Plate In.

بعد ذلك، اختر "القراءة الآن" (Read Now) من علامة تبويب اللوحة، وكرر عملية القراءة كل 24 ساعة، حتى 96 ساعة بعد الاستزراع. ولتحليل صورة ما، انقر فوق علامة تبويب "البيانات" (Data) في اللوحة التي تم تصويرها، واختر "صورة GFP 469, 525 بالإضافة إلى الحقل المضيء" (Picture GFP 469, 525 plus Bright Field). ثم، انقر نقرًا مزدوجًا فوق البئر المصوَّر.

الآن، انقر فوق صورة محملة. اختر Analyze، ثم حدد الصورة المنفردة من المونتاج المراد تحليلها. بعد ذلك، انقر فوق OK. وفيما يلي، قم بتحديد قناة GFP فقط، واضبط المعلمات كما هو موضح في الجدول 3.

بعد ذلك، انقر فوق Start لتطبيق المعلمات على الخلايا المصورة. لاحظ قناع عد الخلايا الموضوع فوق الخلايا المصورة، والذي يُستخدم لتحديد عدد الخلايا في كل صورة. انقر فوق Apply Changes، وحافظ على هذه الإعدادات لكل طبق يتم تصويره طوال التجربة.

في هذا الشكل، تم إجراء تحليل انحدار خطي لمقارنة العلاقات الارتباطية بين الطرق المختلفة التي تم فحصها لقياس تكاثر الخلايا في خلايا MCF-7-LeGO وخلايا MCF-7-delta 40p53. تم حساب معامل ارتباط بيرسون، وتحديد الدلالة الإحصائية بين الطرق المختلفة المستخدمة في قياس تكاثر الخلايا. ولوحظ أن أقوى ارتباط كان بين المقارنة بين المقايسة القائمة على التألق الحيوي وجهاز تصوير الخلايا.

تظهر هنا الصور التمثيلية لخلايا سرطان الثدي MCF-7-LeGO و MCF-7-delta 40p53 الموجبة لبروتين GFP، والتي تم التقاطها باستخدام مصور الخلايا كل 24 ساعة حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تقارب 100%. توفر هذه الطريقة معلومات خلوية مفيدة، بما في ذلك القدرة على مراقبة نمو الخلايا بصرياً على مدار عدة أيام، ومقارنة حجم الخلايا ومورفولوجيتها بين الخطوط الخلوية المختلفة. يظهر هنا ملخص للمزايا والعيوب لكل طريقة تم اختبارها، مما يوضح تعدد استخدامات كل من هذه الطرق وسيساعد القراء في اختيار الطريقة الأكثر ملاءمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لثلاث مقاييس مختلفة لتكاثر الخلايا، وستتمكن من تحديد المقياس الذي يناسب تصميمك التجريبي بشكل أفضل.