مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي

الهدف العام من هذا العرض التوضيحي هو مقارنة ثلاثة فحوصات مختلفة لتكاثر الخلايا وتقديم مزايا وعيوب كل طريقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث السرطان ، مثل استخدام أنسب طريقة لتكاثر الخلايا. يعد إعداد هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات تصوير الخلية.

إنها تتطلب منك التركيز على الخلايا قبل تطبيق قناع عد الخلايا المناسب. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة خطين من خلايا MCF-7 لمدة ثلاثة أيام إلى 75 إلى 80٪ من التقاء في قوارير زراعة الأنسجة T75 سنتيمتر مربع باستخدام DMEM الخالي من الفينول باللون الأحمر. بعد ثلاثة أيام ، قم بإزالة الخلايا من القوارير عن طريق سكب الوسط في حاوية نفايات.

ثم اغسل طبقة الخلية على الفور بملليلترين من التربسين المسخن مسبقا مرتين. استنشق التربسين ، وأضف ملليلترين آخرين من التربسين الدافئ مسبقا إلى طبقة الخلية قبل وضعها في حاضنة. بمجرد انفصال الخلايا ، اغسلها ب 10 ملليلتر من DMEM الطازج الدافئ.

بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 15 مليلتر وقم بطرده لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، استنشق بعناية وتخلص من المادة الطافية بعد ذلك, إعادة تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من DMEM الطازجة المكملة.

لإجراء تعداد الخلايا ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 900 ميكرولتر من مرة واحدة DPBS. بعد ذلك ، ضع مستشعر جديد بحجم 60 ميكرومتر على عداد الخلية الآلي. اضغط باستمرار على المكبس واغمر المستشعر في تعليق الخلية المخفف.

حرر المكبس ببطء على عداد الخلية. ثم قم بإزالة المستشعر من عداد الخلايا عند الانتهاء. قم بزرع الخلايا في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر في صفيحة 96 بئرا عند حوالي 20٪ من التقاء لإتاحة مساحة لنمو الخلايا وقياس التكاثر على مدى ثلاثة إلى خمسة أيام.

لتحديد عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ، قم بتسخين كل من الوسط والتربسين مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا أو الفرن أو الحمام المائي. بعد ذلك ، استنشق الوسط من الخلايا إلى حاوية نفايات. ثم اغسلها مرة واحدة باستخدام 30 ميكرولتر من التربسين مرتين وشفط الوسط في حاوية النفايات مرة أخرى.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرة أخرى ب 30 ميكرولتر من التربسين مرتين ، واحتضنها لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق على حافة اللوحة لإخراج الخلايا. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من DMEM المكملة واخلط الخلايا عن طريق سحب العينات حتى يتم تشكيل معلق خلية واحدة.

ضع زلة الغطاء الزجاجي فوق غرف العد وقم بتثبيتها حتى تظهر حلقات انكسار نيوتن بين حواف انزلاق الغطاء ومقياس الهيليسيليتور. بعد ذلك ، قم بتعبئة 20 ميكرولترا من الخلية برفق تحت زلة الغطاء واسمح لغرفة العد بالحركة الشعرية. بعد ذلك ، تصور غرف العد في تخطيط الشبكة تحت تكبير 10x.

في هذا الإجراء ، قم بإذابة كاشف اللمعان في حمام مائي 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اقلب الزجاجة برفق للحصول على مزيج متجانس. ثم قم بموازنة صفيحة واحدة من الخلايا المصنفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من كاشف اللمعان إلى كل بئر. امزج المحتويات على شاكر مداري لمدة دقيقتين. ثم اترك الطبق يحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لإعداد تجربة تلألؤ باستخدام برنامج قارئ الألواح متعدد الأوضاع ، قم بتشغيل قارئ الألواح متعدد الأوضاع وافتح البرنامج. في إدارة المهام، حدد التجارب وإنشاء جديد. ثم حدد ملف من شريط الأدوات الجانبي، وضمن علامة التبويب البروتوكول، حدد الإجراء.

بعد ذلك ، حدد Greiner 96 Flat bottom كنوع اللوحة ، وحدد ملف استخدم الغطاء مربع. حدد إجراء القراءة ضمن مربع طريقة القراءة. بعد ذلك ، حدد Luminescence كطريقة الكشف وانقر فوق مربع OK.In خطوة القراءة ، وحدد الآبار المراد مسحها ضوئيا ضمن علامة التبويب Full Plate ، وحدد الآبار لتعمل كآبار فارغة.

قم بتعيين مجموعة عوامل التصفية إلى عامل تصفية فارغ. اضبط الكسب على 135 ، مع وقت تكامل يبلغ 5 ثوان لكل بئر وارتفاع قراءة يبلغ 6.5 ملم. انقر فوق موافق لحفظ إعدادات قراءة التلألؤ.

لإجراء قراءة تلألؤ، أخرج حامل اللوحة عن طريق تحديد علامة التبويب التحكم في الجهاز وانقر فوق Plate Out. ضع اللوحة التي تحتوي على 96 بئرا على حامل اللوحة ، مع التأكد من تشغيل الغطاء. أغلق حامل اللوحة بالنقر فوق Plate In ضمن علامة التبويب Instrument Control.

ثم انقر فوق اقرأ الآن في شريط الأدوات لإجراء قراءة مضيئة. بعد ذلك ، قم بتصدير قياسات RLU لكل بئر إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل. لإعداد تجربة تصوير خلية، قم بتشغيل جهاز تصوير الخلايا متعدد الأوضاع وافتح البرنامج.

في إدارة المهام، حدد علامة التبويب التجارب وإنشاء جديد. في شريط أدوات الملف، انقر فوق علامة التبويب بروتوكول ثم علامة التبويب الإجراء. حدد إجراء ضبط درجة الحرارة.

اضبط الحاضنة على تشغيل، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. حدد Preheat ، ثم انقر فوق OK لحفظ الإعدادات. بعد ذلك، حدد إجراء القراءة.

انقر فوق الصورة كطريقة للكشف. ثم حدد نوع القراءة نقطة النهاية/الحركية ونوع بصريات عوامل التصفية، وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، انقر فوق لوحة كاملة علامة التبويب ، وحدد الآبار الموجودة على اللوحة المراد تصويرها. انقر فوق موافق لحفظ الإعدادات.

الآن ، حدد هدف 2.5 مرة من خيار الأهداف المنسدلة. ضمن علامة التبويب القنوات ، حدد GFP 469.525 و Bright Field. تحقق من التعريض الضوئي التلقائي لكلتا القناتين، وحدد التعريض الضوئي التلقائي جيدا.

لتحديد إعدادات التركيز البؤري التلقائي، انقر على خيارات. بالنسبة لخيارات التركيز التلقائي ، حدد الطريقة مسح ضوئي ثم التركيز التلقائي. انقر فوق موافق لحفظ الإعدادات.

بعد ذلك ، اضبط الإزاحة الأفقية والرأسية من مركز البئر على الصفر. حدد لمسح صور متعددة ضوئيا لكل بئر في مونتاج ثلاثة في اثنين. ثم انقر فوق "موافق" لحفظ إعدادات الإجراء.

لقراءة التجربة على اللوحة المحددة ، انقر فوق علامة التبويب التحكم في الأداة وحدد وظيفة إخراج اللوحة. ضع لوحا سعة 96 بئرا على حامل اللوحة ، مع التأكد من تشغيل الغطاء. ضمن علامة التبويب التحكم في الجهاز، حدد وظيفة Plate In.

بعد ذلك ، حدد اقرأ الآن من علامة تبويب اللوحة ، وكرر القراءة كل 24 ساعة ، حتى 96 ساعة بعد البذر. لتحليل صورة ، انقر فوق علامة التبويب "بيانات" على اللوحة المصورة وحدد الصورة GFP 469 ، 525 بالإضافة إلى المجال الساطع. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق البئر المصور.

الآن ، انقر فوق صورة محملة. حدد تحليل، ثم حدد الصورة المفردة للمونتاج المراد تحليلها. بعد ذلك ، انقر فوق موافق. وبعد ذلك، تحقق من قناة GFP فقط، وقم بتعيين المعلمات كما هو موضح في الجدول 3.

بعد ذلك ، انقر فوق ابدأ لتطبيق المعلمات على الخلايا المصورة. لاحظ قناع عد الخلايا الموضوع فوق الخلايا المصورة، والذي يستخدم لتحديد عدد الخلايا لكل صورة. انقر فوق تطبيق التغييرات، واحتفظ بهذه الإعدادات لكل لوحة تم تصويرها طوال التجربة.

في هذا الشكل ، تم إجراء تحليل الانحدار الخطي لمقارنة العلاقات المترابطة بين الطرق المختلفة التي تم فحصها لقياس تكاثر الخلايا في خلايا MCF-7-LeGO وخلايا MCF-7-delta 40p53. تم حساب معامل ارتباط بيرسون ، وتم تحديد الأهمية بين الطرق المختلفة لقياس تكاثر الخلايا. لوحظ أقوى ارتباط بين مقارنة المقايسة القائمة على اللمعان وتصوير الخلية.

تظهر هنا الصور التمثيلية لخلايا سرطان الثدي MCF-7-LeGO و MCF-7-delta 40p53 الإيجابية ل GFP التي تم التقاطها باستخدام جهاز تصوير الخلية كل 24 ساعة حتى تصل الخلايا إلى ما يقرب من 100٪ من التقاء. توفر هذه الطريقة معلومات خلوية مفيدة ، بما في ذلك القدرة على مراقبة نمو الخلايا بصريا عبر عدة أيام ، ومقارنة حجم الخلية ومورفولوجيا الخلية بين خطوط الخلايا المختلفة. يتم عرض ملخص لمزايا وعيوب كل طريقة تم اختبارها هنا ، مما يوضح تعدد استخدامات كل طريقة وسيساعد القراء في اختيار الطريقة الأنسب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لثلاثة فحوصات مختلفة لتكاثر الخلايا ، ويجب أن تكون قادرا على تحديد أيها يناسب تصميمك التجريبي.