التدرج الكثافة متعدد الطبقات البلمرة (DGMP): تقنية جديدة لإنشاء موضوع متعدد المقصورة، السقالات للهندسة الأنسجة تخصيص

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء سقالة ثقافة خلوية متعددة الطبقات. سيوضح هذا الفيديو كيفية إنتاج مصفوفة ثقافة خلية ثنائية الأبعاد ، مع دمج ببتيد الالتصاق RGDS في طبقات بديلة لفصل مناطق C اثنين من خلايا C 12. يتم تحقيق ذلك عن طريق ربط ببتيد RGDS أولا بماكرو مخلص ل acro.

ثم يتم تمييز تركيبة الببتيد الماكرو بصبغة LOR للسماح بتصور الببتيد الذي يحتوي على طبقات من المواد الهلامية متعددة الطبقات. الخطوة الثانية هي تشكيل القوالب عن طريق قطعها من لوح سيليكون ووضعها بين شريحتين زجاجيتين بعد الطبقة ، وخلط المكونات الفردية لكل طبقة. يتم وضع حلول peg di acrl و peg di acrl مع PEG RGDS Alexa three 50 بدلا من ذلك داخل القوالب.

يتم بلمرة المواد الهلامية عن طريق الأشعة فوق البنفسجية. الخطوة الأخيرة هي زرع خلايا C اثنين من خلايا C 12 على مواد هلامية ثنائية الأبعاد متعددة الطبقات من أجل فحص كيفية تأثير تكوين المصفوفة على نمو الخلايا وارتباطها. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الساطع والفلوري لتصور النمو الانتقائي لخلايا C اثنين من خلايا C 12 على السقالات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لإنشاء مصفوفات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات. لا يعتمد على الحاجة إلى أجهزة باهظة الثمن. في حين أن الواجهات بين الطبقات متجاورة ومتكاملة من الناحية الهيكلية.

لا يوجد خلط بين مكونات الطبقات الفردية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية مثل كيفية هجرة الخلايا واستقطابها استجابة للإشارات البيولوجية والكيميائية والميكانيكية المنقوشة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لطيفة على هجرة الخلايا وتمايزها ويمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل توجيه النمو الصحيح الجديد وتكوين التشابك العصبي للخلايا الجذعية العصبية.

لبدء هذا الإجراء ، اجمع بين ببتيد RGDS و زيت أكرو إيستر سكسينيل كربو ميثيل إستر بنسبة واحد إلى اثنين إلى واحد في DMSO الجاف تحت Argonne. ثم أضف NN diop أو بروبيل ميثيل أمين أو D-I-P-E-A بنسبة اثنين إلى واحد مولار بالنسبة إلى aquilo PEG SCM للمساعدة في تسهيل التفاعل ، وتأكيد اقتران جزيء aquilo PEG RGDS باستخدام قياس الطيف الكتلي TOF المتعفن. لهذا بشكل منفصل ، أضف ميكرولتر واحد من محلول تفاعل AQUILO PEG RGDS ، وميكرولتر واحد من aquilo PEG SCM غير التفاعلي إلى أماكن مختلفة على الهدف المتعفن.

دعهما يجف. ثم قم بإعداد محلول مشبع من مصفوفة متعفنة عالمية في دوامة THF لمدة دقيقة واحدة وأضف ميكرولتر واحد إلى نفس النقطتين. دعهما يجف.

بعد ذلك ، قم بتحميل العينات. قم بإجراء تحليل صعب متعفن باستخدام ليزر 60 هرتز بقوة 19٪ تقريبا باستخدام SAVIS gole لتنعيم القبعة العلوية والطرح الأساسي وخوارزميات الكشف عن ذروة OID. يجب تحويل الوزن الجزيئي ل acro PEG RGDS إلى اليمين ، بما يتوافق مع التغير في الكتلة بسبب الببتيد المرتبط تساهميا.

الخطوة التالية هي اقتران الفلور عن طريق إضافة كمية متساوية المولار من LOR ثلاثة حمض كربوكسيل 50 يمتص إستر الوسيط بالنسبة إلى aquilo PEG SCM المذاب في حجم ضئيل من DMSO إلى محلول تفاعل aquilo PEG RGDS تحت الحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتنقية ربط زيت الأكرو RGD S3 50 عن طريق غسيل الكلى ضد ماء الصبغة عند أربع درجات مئوية باستخدام كاسيت غسيل الكلى المقطوع بالوزن الجزيئي 3 ، 500 DAU. استمر في غسيل الكلى لمدة 48 ساعة باستخدام نسبة حجمية 1001 ، وتبادل غسيل الكلى البارد مرتين على الأقل يوميا.

يتم تنقية المنتج بشكل أكبر عن طريق تعقيم الفلتر من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون. أخيرا ، في بيئة معقمة ، قم بنقل ربط زيت الأكرو المنقى المعقم RGD S3 50 في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة مرجحة مسبقا. أغلق أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المفتوحة داخل أنابيب التنفس المعقمة.

تجميد العينات المجففة وتخزين كل منها مختومة بغشاء البارافين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. ينزلق الغسيل المسبق في 100٪ من الميثانول ويجف في فرن على حرارة 80 درجة مئوية حتى يتبخر السائل. ثم ضع طبقا يحتوي على الشرائح الزجاجية في غطاء الدخان وأضف 250 ميكرولتر من طبقة السيجما إلى كل شريحة.

هز الشرائح برفق لمدة 30 ثانية لتغطية السطح بالكامل. بعد ذلك ، اشطف الشرائح المطلية جيدا بالميثانول بنسبة 100٪ ، متبوعا بغسلها والماء المقطر ، عن طريق نقعها مرتين لمدة خمس دقائق في 10 مل على الأقل من الماء. بمجرد شطفها ، اترك الشرائح تجف في الهواء.

قم بإعداد مساحات سيليكون بسمك 0.8 مم عن طريق تقليم لوح من السيليكون بنفس أبعاد الشرائح الزجاجية. ثم باستخدام لكمات الخزعة ، قم بعمل ثقوب بحجم 10 ملم أو ثمانية ملليمترات في السيليكون لتثبيت السقالات باستخدام شفرة حلاقة. اصنع حوالي قناتين ملليمتريتين في الجزء العلوي من القالب للسماح بإضافة مادة السقالات.

ثم قم بتعقيم مساحات السيليكون والشرائح الزجاجية المعالجة بطبقة سيجما لتعقيمها. قم أيضا بتعقيم المواد الإضافية لصب المواد الهلامية مثل أنابيب einor والملقط. في مرشح غطاء محرك السيارة لزراعة الأنسجة ، قم بتعقيم محلول مخزون Peg di aquil باستخدام حقنة معقمة سعة مليلتر واحد وفلتر 0.2 ميكرون.

ابدأ بصياغة محاليل PEG pre polymer بنسبة 15٪ من الوزن إلى الحجم لكل طبقة من كل طبقة في أنابيب النفايات الدقيقة الكهرمانية الفردية من خلال الجمع بين 50٪ PEG D acrl مع كميات مختلفة من محلول مخزون IO DAL المعقم 60٪ IO DAL PBS وبادئ الصور للحصول على تركيزات نهائية متفاوتة تبلغ 10٪ 20٪ 30٪ و 40٪ من خلط المحاليل جيدا لإعداد محلول البوليمر المسبق PEG المسمى بالفلورسنت ، الجمع بين 50٪ PEG di aquil و aquilo PEG RGD S3 50 بتركيز نهائي يبلغ ثمانية مللي مولار مع محلول مخزون IO Dal PBS وبادئ الصورة في أنابيب Microview الكهرمانية لإنتاج تركيزات 15٪ 25٪ و 35٪ IO IAL تخلط الحلول تماما. بعد ذلك ، قم بتجميع القالب الذي تم إعداده عن طريق وضع فاصل مسبق القطع بين شريحتين زجاجيتين معالجتين من سيجما وتأمينها بالمشابك. بمجرد تجميع القالب ، قم بصب هلام متعدد الطبقات عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول 40٪ أولا ، متبوعا ب 10 ميكرولترات من محلول 35٪ المسمى بالفلورسنت.

كرر الطبقات البديلة لتحقيق عدة طبقات. بعد ذلك ، قم بإشعاع القالب بضوء 365 نانومتر لمدة ثلاث دقائق. باستخدام مصباح محمول للأشعة فوق البنفسجية 9 ، 000 ، اسمح للهلاميات المبلمرة بالمعالجة لمدة خمس دقائق.

ثم قم بإزالة المشابك وارفع الشريحة الزجاجية العلوية والقالب برفق. تدرج الكثافة الطبقي. ستبقى البلمرة المتعددة أو المواد الهلامية DG MP على الشرائح.

باستخدام ملعقة معقمة ، قم بإزالة المواد الهلامية بعناية من القالب وضعها في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على DMEM معقم. اغسل المواد الهلامية المبلمرة باستخدام نسبة حجمية 1000 إلى واحدة من DMEM لمدة 48 ساعة مع تبادلين عازلين يوميا. سيؤدي ذلك إلى إزالة أي كثافة ، ومعدل ، وبادئ صور ، وعلى البوليمر المسبق للتفاعل.

ثم قم بتخزين المواد الهلامية DGMP في DMEM المكملة ب 1٪ بنسلين ستربتومايسين. لتصور الطبقات المتناوبة ، قم بترتيب جل DGMP على طول المسطرة على صينية العينات الخاصة بوحدة توثيق الجل. ثم قم بكشف وتصوير المواد الهلامية باستخدام Alexa ، وثلاثة 50 نطاقا داكنا وزرقاء بالتناوب في DGMP hydrogel تظهر تكوين طبقات سرية من التركيب الكيميائي المميز.

لتحضير المواد الهلامية DGMP لزراعة الخلايا ، أدخلها برفق في آبار لوحة زراعة الخلايا المكونة من 48 بئر. باستخدام مكشطة خلية معقمة وشطفها ثلاث مرات في وسط زراعة الخلايا. بعد ذلك ، قم بحصاد C اثنين من الأرومة العضلية C 12 من صفيحة زراعة الخلايا 100 ملم عندما تكون متقاربة بنسبة 60٪.

للقيام بذلك ، اشطف اللوحة ثلاث مرات باستخدام PBS الدافئ. ثم أضف ملليلترا واحدا من 0.25٪ رحلات في EDTA واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف ملليلترا واحدا من وسط الثقافة الدافئة وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للطرد المركزي.

بعد أن يتم تكوير الخلايا ريس ، قم بقلمها في وسط النمو وعد الخلايا الحية عن طريق إضافة الزرقاء الزرقاء واستخدام عداد خلايا TC 10. ثم قم بزرع سقالة DG MP ب C اثنين من الأرومات العضلية C 12 واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكد من إرفاق الخلايا العضلية C اثنين من C 12 على RGDS التي تحتوي على طبقات من المواد الهلامية DGMP باستخدام مضان epi والفحص المجهري لتباين الطور.

قد تحتوي الطبقات المتناوبة من المواد الهلامية DGMP على ببتيدات مختلفة مثل RGDS الموضحة على اليمين ، والتي تدعم الارتباط الخلوي والنمو. ومع ذلك ، لم تحتوي الطبقة الموجودة على اليسار على أي ببتيدات مرفقة خلوية ولم تنجو الخلايا في تلك المنطقة. يمكن أن يؤثر IO diol على تصلب الجل.

هنا ، تم قياس معامل المرونة باستخدام مجهر القوة الذرية. لوحظت زيادة بنسبة 60٪ في الصلابة عند استخدام 30٪ IAL في تركيبة الجل هذه ، ويمكن أن يختلف تأثير IAL على صلابة الجل بناء على المواد المستخدمة أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسلسل الطبقات. ستكون الطبقة التي تحتوي على أكبر قدر من IEX null في الأسفل ، بينما ستكون الطبقة التي تحتوي على أقل كمية من IEX null في الأعلى.

تذكر دائما إضافة بادئ الصور في النهاية لمنع البلمرة من الضوء المحيط. مع المتعاونين معنا ، نقوم بتكييف هذه التقنية لتنظيم نمو العصبة في 3D. سيسمح ذلك بمقارنات بين الخلايا السلفية العصبية المشتقة من الأفراد الأصحاء وتلك الموجودة في المرضى الذين يعانون من اضطرابات النمو العصبي.

لا تنس أن العمل مع الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا. ارتد نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية أثناء تنفيذ خطوة الربط المتقاطع.