بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات التصنيع البسيط والمعالجة والتجميع لصفائح الهيدروجيل المعيارية لنظام زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة مثل كيفية إنشاء المزيد من الأنسجة الوظيفية الشبيهة بالجسم الحي مع بيئات دقيقة مستنبتة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنشاء تركيبات هيدروجيل خلوية دون أي زيادة مكلفة.

ستعتمد ظروف زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد على كل ورقة هيدروجيل معيارية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تحسين المقايسات القائمة على الخلايا والدراسات البيولوجية لأن هذه التقنية يمكن أن توفر العديد من الأشكال الهندسية وتكوين البيئات الخلوية الدقيقة والكلية ثلاثية الأبعاد. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على المقايسات القائمة على الخلايا في المختبر ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها على نظام آخر مثل السقالة القابلة للزرع لنموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد.

ابدأ بإنتاج الأنماط الدقيقة المرغوبة باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية. سيستخدم المثال الموضح في هذا الفيديو نمطا شبكيا يشبه فصيص الكبد مثل النمط الموضح هنا. بعد ذلك ، قم بوزن 2.5 جرام من PDMS و 2.5 جرام من محلول عامل المعالجة واخلط المكونات معا جيدا.

قم بإزالة الغاز من المحلول في غرفة مفرغة ثم انشر المحلول المختلط على سطح النمط الدقيق لرقاقة السيليكون بالتساوي داخل طبق صب رقائق معدنية. بعد ذلك ، قم بمعالجة PDMS عن طريق وضع الطبق على سطح مستو لصفيحة ساخنة بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بمجرد الشفاء ، قم بإزالة PDMS من طبق الصب وقشره بعناية بعيدا عن رقاقة السيليكون.

اقطع حواف PDMS وضع الجزء المزخرف على طبق بتري بقطر 100 ملم بحيث يكون الجانب الدقيق متجها لأعلى. بعد ذلك ، اغسل PDMS المشكل بدقة 70٪ من الإيثانول ، متبوعا بالماء المقطر ، للتعقيم الأولي. بعد ذلك ، جفف الإعداد تماما لمدة 10 دقائق في فرن على حرارة 65 درجة مئوية.

بعد ذلك ، ضع قالب PDMS المزخرف بشكل دقيق في منظف البلازما ونظفه لمدة دقيقة واحدة لإنشاء سطح محب للماء. هذا سوف يسهل تحميل السوائل المائية. ثم قم بتغطية سطح PDMS ب 100 مل من محلول الفاعل بالسطح المدرج في جدول المواد.

احتضان العينات على هزاز المختبر لمدة ثلاث ساعات على الأقل. بعد ذلك ، اغسل محلول الفاعل بالسطح من قوالب PDMS باستخدام ماء معقم ، وجففها تماما في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتعقيم كل قالب منقوش عن طريق تعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

ابدأ بزراعة خلايا hepg2 باستخدام التقنيات القياسية. بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ إلى 80٪ ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا عن طريق إضافة مليليتر واحد بنسبة 05٪ تريبسين إدتا واحتضانها لمدة أربع دقائق عند 37 درجة مئوية.

بمجرد فصلها ، اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي وحبيبها عند 250 جم لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ثم أعد تعليق الخلايا في مليليتر واحد من PBS. احسب عدد الخلايا الموزعة المفردة في PBS باستخدام عداد خلوي آلي.

ثم ، قم بتحبيير الخلايا مرة أخرى عند 250 جم لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية PBS وأضف ما يكفي من محلول ألجينات الصوديوم بنسبة واحد بالمائة إلى الخلايا بحيث تتراوح كثافة البذر النهائية بين خمسة وعشرة ملايين خلية لكل مليلتر. امزج محلول الخلية برفق باستخدام ماصة ثم احتضن معلق هيدروجيل الخلية في حاضنة مرطبة بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.

أثناء احتضان الخلايا ، ضع قوالب PDMS ذات النمط الدقيق في منظف البلازما ونظفها لمدة دقيقة واحدة عند 85 واط لإنشاء سطح محب للماء. امزج تعليق هيدروجيل الخلية عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل ثم قم بتحميل 7.2 ميكرولتر من التعليق بثبات على حافة النمط الدقيق في القالب. بعد ذلك ، قم بجل تعليق هيدروجيل الخلية عن طريق إنتاج رذاذ من كاشف الربط المتقاطع مع المرطب بمعدل 250 مل في الساعة ورشه على سلائف الهيدروجيل لمدة خمس دقائق.

تأكد من أن هذا الإجراء يغطي السطح الطبوغرافي لقالب PDMS في نطاق خمسة سنتيمترات. بعد عملية الربط المتقاطع ، قم بإيقاف تشغيل جهاز الترطيب واملأ قالب PDMS ب PBS. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بتوزيع PBS برفق حول حافة صفائح الهيدروجيل المتصلبة لفصل كل من الهلاميات المائية.

بعد ذلك، التقط كل لوح هيدروجيل عائم، باستخدام طرف ماصة مقطوع في نهاية السعة، سعة 1,000 ميكرولتر. انقل كل ورقة من الهيدروجيل إلى آبار فردية من صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على مليليتر واحد من DMEM الدافئ مسبقا بحيث تطفو على سطح الوسائط. استزراع الخلايا بهذه الطريقة لمدة أسبوع واحد ، وتبادل وسيط الثقافة كل يومين.

بعد ذلك ، قم بإنتاج إطار PDMS ، والذي يحتوي على هياكل أعمدة عالية 170 ميكرون على السطح السفلي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. أثناء التصنيع ، ضع قالبا متخصصا من البولي كربونات على رقاقة السيليكون لإطار PDMS لإنشاء إطار داخلي بعرض ثمانية ملليمترات ، وارتفاع تسعة ملليمترات ، وعمق ملليمترين. بمجرد التعقيم ، ضع إطار PDMS على ربع قطعة من ورق الترشيح المصنوع من النايلون في طبق بتري مقاس 60 ملم.

قم بإزالة صفائح الهيدروجيل من الحاضنة وانقل أول صفائح الهيدروجيل المعيارية إلى الجزء الداخلي من إطار PDMS باستخدام طرف ماصة مقطوع في النهاية سعة 1,000 ميكرولتر. قم بمحاذاة حافة لوح الهيدروجيل المعياري مع إطار PDMS باستخدام طرف ماصة فارغ سعة 200 ميكرولتر. كرر هذه العملية مع صفائح هيدروجيل إضافية حتى يتم الحصول على كومة من أربع إلى ست طبقات.

بعد ذلك ، قم بإزالة وسيط الثقافة عن طريق تدفقه عبر هياكل الأعمدة في الجزء السفلي من إطار PDMS. ثم أضف ميكرولترين من محلول الجينات بنسبة اثنين بالمائة في أحد أركان البناء متعدد الطبقات. باستخدام جهاز ترطيب ، رش رذاذ من كاشف الربط المتقاطع بمعدل 250 مل في الساعة على الهيكل متعدد الطبقات لمدة ثلاثين ثانية لربط حواف كل طبقة معا.

بعد ذلك ، اشطف البنية متعددة الطبقات برفق باستخدام 400 ميكرولتر من DMEM وقم بإزالة إطار PDMS باستخدام الملقط. ثم أضف أربعة ملليلتر إضافي من DMEM. افصل البنية متعددة الطبقات بورق الترشيح عن طريق مسحها برفق باستخدام رافع الخلايا ثم استخدم ورق الترشيح لنقله إلى صفيحة من ستة آبار تحتوي على ثلاثة ملليلتر من DMEM.

قم بزراعة الخلايا بطريقة عائمة باستخدام هيكل هيدروجيل كسقالة خلوية متعددة المقاييس في الصفيحة المكونة من ستة آبار لمدة أسبوع واحد على الأقل. تبادل وسيط الثقافة كل يومين. تظهر هنا نتيجة تجميع طبقة تلو الأخرى من صفائح الهيدروجيل الدقيقة الشبيهة بفصيصات الكبد ، حيث نمت خلايا سرطان الكبد البشري ذات اللون الأخضر الفلوري والخلايا الليفية NIH-3T3 ذات اللون الأحمر الفلوري معا في زراعة مشتركة على شبكة مشتركة.

باستخدام التقنية المعروضة هنا ، يمكن إنشاء العديد من اختلافات الأنماط ، بما في ذلك الأعمدة السداسية ، والشبكات الرفيعة ، والمصفوفات الكاملة ، والألياف الدقيقة المتعددة التي تشبه المشط الدقيق في شكل بنية هيدروجيل رقيقة في حدود 100 إلى 200 ميكرومتر. توفر هذه الهياكل بيئة ثقافة ثلاثية الأبعاد غنية للعديد من أنواع الخلايا المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء صفائح هيدروجيل خلوية للهندسة في أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد الشبيهة بالجسم الحي من الأسفل إلى الأعلى.