GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على بروتين مستهدف عالي النقاء وبطوله الكامل. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إنتاج فيروس bao مؤتلف، والذي يُستخدم لإصابة خلايا الحشرات SF nine من أجل الحصول على نسخة من البروتين المستهدف عالية التعبير وقابلة للذوبان وتحتوي على علامتين (two tagged). بعد ذلك، يتم إجراء تنقية بالتقارب على خطوتين، تتميز بتنقية البروتين الموسوم بـ glutathione وseros، يتبعها كروماتوغرافيا التقارب المعدني.

تكون نتيجة عملية التنقية بروتيناً عالي النقاوة موسوماً بالهيستيدين. تالياً، يتم إجراء الديلزة لعينات البروتين المُنقى لضمان انخفاض تركيزات الأملاح في محلول التخزين المنظم. وتُستخلص النتائج التي توضح ذوبانية التعبير، وكمية البروتين، وجودته، وذلك استناداً إلى صبغ البروتين الكلي في هلام SDS-PAGE.

جاءتنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما واجهنا صعوبات في تنقية البروتينات الكبيرة وغير المستقرة مثل PAL B two و BOC two. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التنقية بالتآلف ذات الخطوة الواحدة، تتمثل في أن البروتين الذي يتم الحصول عليه في بروتوكول التنقية بالتآلف ذو الخطوتين يكون عالي النقاء وخالياً بشكل عام من نواتج التحلل. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا البروتين، مثل الوظائف البيوكيميائية للبروتينات المؤشابة المنقاة.

يبدأ هذا البروتوكول بإنتاج فيروس bao المؤتلف، يليه اختيار أكثر فيروسات BA كفاءة كما هو موضح في البروتوكول النصي للعدوى. قم بتحضير وعاء زراعة دوارة يحتوي على ما بين 0.75 إلى 1.0 × 10⁶ من خلايا SF nine في 500 milliliters من الوسط الغذائي، بنسبة تتراوح بين 1 إلى 150 بين الفيروس والوسط. ضع الدوارة تحت غطاء زراعة الخلايا، ثم قم بإصابة الخلايا عن طريق إضافة الحجم المطلوب من معلق فيروس baula إلى معلق الخلايا عبر أحد أذرع الدوارة.

اترك الخلايا المصابة لتنمو في معلق عند 27 درجة مئوية واجمع الخلايا عند الوصول إلى أقصى تعبير بروتيني، وهو الأمر الذي يتم تحديده عند اختيار الفيروس البكري الأكثر كفاءة. بعد جمع الخلايا، قم بتحليل خلايا SF nine التي تعبر عن البروتين المستهدف في حوالي 20 milliliters من درء ربط GST، المدعم بمثبطات البروتياز في حمام مائي جليدي. مرر المحلول 20 مرة باستخدام مجانس، ثم قم بعملية سونكة لثلاث دورات مدة كل منها 30 ثانية قبل التمرير مرة أخرى لـ 20 مرة. بعد ذلك، قم بطرد محلل الخلايا مركزياً عند 18,000 RPM لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية واحتفظ بالرائق. قم بتحضين محلل الخلايا القابل للذوبان مع 1 milliliter من حبيبات GST المغسولة مسبقاً لمدة ساعة واحدة عند 4 درجة مئوية تحت دوران خفيف.

يجب تحسين وقت الحضانة وفقاً لاستقرار البروتين وكفاءة الارتباط بعد عملية الارتباط. يتم إجراء دوران سريع بسرعة 700 RPM وإزالة الطافي الذي يحتوي على البروتينات غير المرتبطة. تُغسل البروتينات المرتبطة بـ GST باستخدام محلول غسيل GST.

كرر هذه العملية مرتين بعد الغسلة الأخيرة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي. ثم قم بحضن الخرز مع 5 millimolar ATP و 15 millimolar كلوريد المغنيسيوم في 10 milliliters من منظم ربط GST لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C لتجنب الارتباط غير النوعي لبروتينات الصدمة الحرارية بعد الحضن.

اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل GST المنظم. بعد طرد حبيبات GST مركزياً وإزالة الراشح، اغسل حبيبات GST باستخدام محلول P five المنظم. بعد ذلك، قسم حبيبات GST إلى أجزاء سعة كل منها 100 µL وأضف من 4 إلى 8 وحدات من إنزيم precision المخفف في 100 µL من محلول P five المنظم.

يتم تحضين حبيبات GST مع الإنزيم لمدة تتراوح من ثلاث ساعات إلى ليلة كاملة عند درجة حرارة 4 °C مع تدوير هادئ. يجب تحسين وقت التحضين بناءً على الوزن الجزيئي واستقرار البروتين بعد عملية القطع. يتم إجراء دوران سريع (Quick spin) ثم جمع الراشح.

أضف 100 µL من منظم P five إلى الخرز. ثم كرر عملية الطرد المركزي وجمع السائل الطافي مرتين. اسحب جميع الأجزاء.

قسّم الـ EIT إلى ثلاثة أجزاء بحجم 1 ml لكل جزء، واحضن كل منها مع 100 µL من حبيبات راتنج Talon ذات الألفة للمعادن المغسولة مسبقاً لمدة ساعة واحدة مع التدوير؛ حيث يؤدي تقسيم الاستخلاص إلى عدة أجزاء إلى زيادة كفاءة الارتباط والغسيل. بعد ذلك، اغسل الراتنج لمدة خمس دقائق باستخدام منظم P 30 عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير اللطيف. وبعد تكرار عملية الغسيل مرتين، اجمع الحبيبات في أنبوب واحد لاستخلاص البروتين المنقى.

أضف منظم P 500 إلى راتنج talon المرتبط بالبروتين. أضف المنظم بحيث تكون نسبة حجم المنظم إلى حجم الحبيبات واحد إلى واحد. قم بتحضين المعلق لمدة خمس دقائق مع التدوير.

كرر هذه الخطوة مرتين. مع الحفاظ على كل جزء مستخلص بشكل منفصل لتخزين البروتين المُنقى. قم بإجراء ديالزة للبروتين مقابل محلول تخزين مناسب مرتين لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب.

من المهم التحقق من حدوث ترسيب للبروتين المُنقى أثناء عملية الديلزة. قم بتجزئة البروتين المُنقى إلى حصص صغيرة وقم بتجميدها على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة. تُحفظ هذه الحصص في درجة حرارة 80- درجة Celsius مع تجنب تكرار دورات التجميد والإذابة.

قم بتحليل عملية التنقية عن طريق تحميل ما يقرب من 20 إلى 40 µL من كل جزء على هلام SDS page. بعد تشغيل الهلام، يتم الصبغ باستخدام Coomassie blue أو صبغة البروتين للتصور؛ حيث تم تحليل نواتج تحلل الخلايا الذائبة والكلية من خلايا SF nine المصابة بفيروس valo المؤتلف REC 14 أو المصابة وهمياً كعينة ضابطة عن طريق الصبغ بـ Coomassie blue، مما سمح بتأكيد تعبير بروتين GST re 14 his خلال عملية التنقية. تم تحليل العديد من العينات لمتابعة كفاءة الطريقة من خلال تحليل هذه العينات باستخدام Coomassie Blue.

يظهر التلوين أنه خلال الخطوة الأولى من التنقية، ارتبط GST Rec 14 بشكل صحيح بحبيبات GST بوزن جزيئي ظاهري يبلغ حوالي 50 kilodaltons نتيجة اندماج rec 14 مع GST، وبعد القطع الدقيق باستخدام G-S-T-G-S-T، يهاجر rec 14 hiss الحر عند حوالي 37 kilodaltons. وبينما يمكن رؤية GST المقطوع على حبيبات GST، ورغم بقاء جزء من GST free REC 14 مرتبطاً بحبيبات GST، فقد تم تحقيق إثراء ملحوظ لـ REC 14 hiss. ويمكن تحسين هذه الخطوة عن طريق زيادة وقت حضانة البروتين مع البروتياز الدقيق؛ ويظهر تحليل REC 14 hiss المرتبط بحبيبات Talon مقارنة بالبروتينات التي تلت خطوة تنقية GST أن جزءاً كبيراً من REC 14 hiss مرتبط بحبيبات talon.

بعد عدة عمليات غسيل، تم استخلاص وجمع REC 14 hiss، وأُجريت ثلاث عمليات شطف. كشف التحليل عن نقاء عالٍ لـ rec 14 hiss، وكان أعلى تركيز لـ rec 14 hiss في أول عملية شطف؛ وبمقارنة الأجزاء المستخلصة بالخرزات الراتنجية بعد الشطف، يتضح مدى كفاءة عملية الاستخلاص، حيث تم رصد كمية ضئيلة فقط من rec 14 hiss مرتبطة بالخرزات.

خضعت هذه العينات أيضاً لتحليل Western blood باستخدام أجسام مضادة لـ GST وأجسام مضادة لـ hiss من أجل تتبع REC 14. وطوال هذه العملية، أظهر تحليل anti GST وجود بعض GS TRE 14 وGST بمفرده في البروتينات المشار إليها من خطوة تنقية GST، وأن الشوائب قد أُزيلت بواسطة خطوة التنقية بتقارب hiss tag. ويكشف هذا التحليل أن GST قد أُزيل بكفاءة من re 14 بواسطة المعالجة الدقيقة وخطوة تنقية hiss ttag.

يهدف لطخة مضاد His إلى الكشف عن re 14. وتؤكد هذه اللطخة أن GST Rec 14 hiss و REC 14 hiss لم يتم شطرهما وإزالتهما بالكامل من حبيبات GST. علاوة على ذلك، يبدو أن REC 14 يتجمع عند التركيزات العالية.

باختصار، توضح النتائج المعروضة كفاءة تنقية GST hiss في تنقية S palm B rec 14. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية استعادة بروتين مأشوب عالي النقاء بمجرد إتقان هذه العملية.

يمكن تنفيذ هذه التقنية خلال 12 ساعة بعد تحلل حمض ly القابل للذوبان إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة القيام بهذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بسرعة وبصرامة عند درجة حرارة 4 °C لتجنب تحلل البروتين بعد هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل مقاييس الترسيب المشترك أو مطيافية الكتلة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد الشركاء البروتينيين أو تعديلات ما بعد الترجمة للبروتين المستهدف.

على الرغم من استخدامنا لهذه الطريقة لدراسة بروتينات إصلاح DNA، إلا أنه يمكن تعديل هذه الاستراتيجية لدراسة وظائف البروتينات في مجالات بحثية أخرى.