GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية
أكتوبر 29, 2013
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود نطاق صغير طريقة تنقية البروتين كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة، والذي يسمح تنقية البروتينات المؤتلف من خلال الجمع بين فريد شطورة GST-علامة وصغيرة صاحب العلامة.
الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على بروتين عالي النقاء وكامل الطول ذي أهمية. يتم تحقيق ذلك من خلال إنتاج فيروس باو المؤتلف ، والذي يستخدم لإصابة تسعة خلايا حشرية SF من أجل الحصول على نسخة عالية الوضوح وقابلة للذوبان من البروتين محل الاهتمام. ثم يتم إجراء تنقية تقارب من خطوتين ، تتميز بتنقية الجلوتاثيون ، والبروتين الموسوم بالأمصال ، متبوعا بكروماتوغرافيا التقارب المعدني.
نتيجة التنقية هي بروتين عالي النقاء يحمل علامة الهيستيدين. بعد ذلك ، يتم غسيل عينات البروتين المنقى من أجل ضمان تركيزات منخفضة من الملح في المخزن المؤقت. تم الحصول على النتائج التي تظهر التعبير عن الذوبان والكمية والجودة للبروتين بناء على صبغة البروتين الكاملة لجل صفحة SDS.
خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما واجهنا مشكلة في تنقية البروتينات الكبيرة وغير المستقرة مثل PAL B two و BOC two. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تنقية التقارب بخطوة واحدة ، هي أنه في بروتوكول تنقية التقارب المكون من خطوتين ، يكون البروتين الذي تم الحصول عليه نقيا للغاية وخاليا بشكل عام من منتجات التحلل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال بيولوجيا البروتين ، مثل الوظائف الكيميائية الحيوية للبروتينات المؤتلفة المنقى.
يبدأ هذا البروتوكول بإنتاج فيروس باو المؤتلف, تليها اختيار فيروس BA الأكثر كفاءة كما هو موضح في بروتوكول النص للعدوى. قم بإعداد وعاء استزراع دوار يحتوي على ما بين 0.75 إلى 1.0 في 10 إلى ست خلايا SF التسع في 500 مل من الوسائط بنسبة واحد إلى 150 بين الفيروس والوسائط. ضع الدوار تحت غطاء مزرعة الخلايا ويصيب الخلايا عن طريق إضافة الحجم اللازم من تعليق فيروس الباولا إلى تعليق الخلية من خلال ذراع واحدة من الدوار.
دع الخلايا المصابة تنمو في معلق عند 27 درجة مئوية وحصاد الخلايا عند الوصول إلى الحد الأقصى لتعبير البروتين ، والذي يتم تحديده عند اختيار الفيروس البقعي الأكثر كفاءة. بعد حصاد الخلايا ، تعبر الخلايا التسع عن البروتين محل الاهتمام في حوالي 20 مل من المخزن المؤقت الملزم لضريبة السلع والخدمات ، مع استكمالها بمثبطات الإنزيم البروتيني في حمام الماء المثلج. أسفل المحلول 20 مرة مع الخالط السفلي ثم صوتنة لثلاث دورات 32 قبل الرقص مرة أخرى 20 مرة بعد ذلك ، الطرد المركزي للخلية تحلل عند 18 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية والحفاظ على المادة الطافية تحتضن محللة الخلية القابلة للذوبان مع مليلتر واحد من حبات ضريبة السلع والخدمات المغسولة مسبقا لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية تحت دوران لطيف.
يجب تحسين وقت الحضانة وفقا لاستقرار كفاءة الاحتراف والربط بعد الربط. يدور بسرعة 700 دورة في الدقيقة ويزيل المادة المطفية التي تحتوي على بروتينات غير مرتبطة. اغسل البروتينات المرتبطة بضريبة السلع والخدمات باستخدام عازلة غسيل ضريبة السلع والخدمات.
كرر هذه العملية مرتين بعد آخر غسلة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. ثم احتضان الخرزات بخمسة ملليمولار A TP و 15 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت المرتبط بضريبة السلع والخدمات لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية لتجنب الارتباط غير المحدد لبروتينات الصدمة الحرارية بعد الحضانة.
اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام عازلة غسيل ضريبة السلع والخدمات. بعد الطرد المركزي لخرز ضريبة السلع والخدمات وإزالة المادة الطافية ، اغسل حبات ضريبة السلع والخدمات باستخدام المخزن المؤقت P خمسة. بعد ذلك ، قسم حبات ضريبة السلع والخدمات ، المخالفات التي تبلغ 100 ميكرولتر وأضف أربع إلى ثماني وحدات من الإنزيم الدقيق المخفف في 100 ميكرولتر من P خمسة عازلة.
احتضان حبات ضريبة السلع والخدمات بالإنزيم لمدة ثلاث ساعات إلى ليلة واحدة عند أربع درجات مئوية تحت دوران لطيف. يجب تحسين وقت الحضانة وفقا للوزن الجزيئي بالإضافة إلى استقرار البروتين بعد الانقسام. تدور بسرعة وجمع المادة الطافية.
أضف 100 ميكرولتر من P خمسة عازلة إلى الخرز. ثم كرر ، وقم بالدوران ، وجمع المواد الطافية مرتين. اسحب كل الكسور.
قسم EIT إلى ثلاثة أجزاء من مليلتر واحد واحتضان كل منها ب 100 ميكرولتر من الخرز الجاف الراتنج المعدني المغسول مسبقا لمدة ساعة واحدة تحت الدوران ، وتقسيم الشطف إلى عدة أجزاء ، ويزيد من كفاءة الربط والغسيل. ثم اغسل الراتنج لمدة خمس دقائق باستخدام المخزن المؤقت P 30 عند أربع درجات مئوية مع دوران لطيف. بعد تكرار الغسيل مرتين ، اسحب الخرزات في أنبوب واحد لتصفية البروتين المنقى.
أضف المخزن المؤقت P 500 إلى راتنج المخالب المرتبط بالبروتين. أضف نسبة مخزن مؤقت إلى حبة من وحدة تخزين واحد إلى واحد. حجم. احتضان التعليق لمدة خمس دقائق تحت الدوران.
كرر هذه الخطوة مرتين. الحفاظ على كل جزء بعيد المنال منفصلا لتخزين البروتين المنقى. غسيل البروتين بالكلات مقابل مخزن تخزين مناسب مرتين لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية تحت التحريض.
من المهم التحقق من ترسيب البروتين المنقى أثناء غسيل الكلى. اصنع كميات صغيرة من البروتين المنقى وقم بتجميدها على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة. قم بتخزين الحصص عند سالب 80 درجة مئوية وتجنب العديد من دورات تجميد الذوبان.
قم بتحليل عملية التنقية عن طريق تحميل ما يقرب من 20 إلى 40 ميكرولترا من كل جزء على هلام صفحة SDS. بعد تشغيل صبغة الجل مع كوماسي الأزرق أو صبغة البروتين للتصور ، تم تحليل تحلل الخلايا القابلة للذوبان والكلية من الخلايا التسع SF المصابة بفيروس فالو المؤتلف REC 14 أو الوهمية المصابة كعنصر تحكم بواسطة تلطيخ كوماسي الأزرق ، مما يسمح بتأكيد التعبير عن ضريبة السلع والخدمات 14 بروتينه أثناء عملية التنقية. تم تحليل العديد من العينات لمتابعة كفاءة تحليل طريقة هذه العينات بواسطة kumasi Blue.
يظهر التلوين أنه خلال الخطوة الأولى من التنقية ، تم ربط GST Rec 14 بشكل صحيح بخرز ضريبة السلع والخدمات بوزن جزيئي واضح يبلغ حوالي 50 كيلودالتون بسبب اندماج rec 14 مع GST بعد الانقسام الدقيق مع G-S-T-G-S-T ، الهسهسة الحرة rec 14 تهاجر حوالي 37 كيلودالتون. بينما يمكن تصور ضريبة السلع والخدمات المشقوقة على حبات ضريبة السلع والخدمات ، على الرغم من جزء من REC 14 الخالي من ضريبة السلع والخدمات الذي لا يزال مرتبطا بخرز ضريبة السلع والخدمات ، فقد تم تحقيق إثراء ملحوظ لهسهسة REC 14. يمكن تحسين هذه الخطوة عن طريق زيادة وقت حضانة البروتين من خلال تحليل دقيق للبروتياز لهسهسة REC 14 المرتبطة بخرز تالون مقارنة بالبروتينات المشار إليها بعد أن تظهر خطوة تنقية ضريبة السلع والخدمات أن جزءا كبيرا من هسهسة REC 14 مرتبط بخرز الحلبة.
بعد عدة غسلات ، تم استخلاص REC 14 وهسهسة ، وتم تنفيذ ثلاثة أوهام. كشف التحليل عن نقاء عال من rec 14 همسة وأكبر تركيز ل rec 14 hiss في المقارنة الإليلوسية الأولى للكسور المراوغة بخرز المخلب بعد أن يوضح Ellucian كفاءة الوهم. نظرا لأنه يمكن اكتشاف الهسهسة الصغيرة 14 على أنها مرتبطة بالخرز.
خضعت هذه العينات أيضا لتحليل الدم الغربي باستخدام الأجسام المضادة المضادة لضريبة السلع والخدمات والأجسام المضادة للهسهسة من أجل اتباع REC 14. طوال الإجراء ، تظهر اللطخة المضادة لضريبة السلع والخدمات أن بعض GS TRE 14 و GST وحدها كانت موجودة في البروتينات المشار إليها من خطوة تنقية ضريبة السلع والخدمات وأن الملوثات تمت إزالتها من خلال خطوة تنقية تقارب علامة الهسهسة. تكشف هذه اللطخة أن ضريبة السلع والخدمات قد تمت إزالتها بكفاءة من إعادة 14 من خلال المعالجة الدقيقة وخطوة تنقية الهسهسة.
تهدف البقعة المضادة للهسهسة إلى اكتشاف إعادة 14. تؤكد هذه اللطخة أن GST Rec 14 همسة و REC 14 لم يتم شقها تماما وإزالتها من حبات ضريبة السلع والخدمات. علاوة على ذلك ، عند التركيز العالي ، يبدو أن REC 14 يجمع.
باختصار ، توضح النتائج المقدمة كفاءة تنقية GST هسهسة لتنقية S palm B rec 14. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استعادة طاقة عالية التجميل. البروتين المدمج بمجرد إتقانه.
يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 12 ساعة بعد تنكس حمض قابل للذوبان إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة وبدقة عند أربع درجات مئوية لتجنب تدهور البروتين باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات ترسيب الكود أو قياس الطيف الكتلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد شركاء البروتين أو التعديل اللاحق للترجمة للبروتين محل الاهتمام.
على الرغم من أننا نستخدم هذه الطريقة للحمض النووي ، إلا أنه يمكن تعديل بروتينات الإصلاح إلى الإستراتيجية لدراسة وظيفة البروتينات في مجالات البحث الأخرى.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة لتنقية البروتينات على نطاق صغير باستخدام علامة GST قابلة للفصل وعلامة His. يتيح هذا النهج العزل الفعال للبروتينات المؤتلفة، مما يضمن نقاءً وقابلية للذوبان عالية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تنقيه البروتينات
- تعبير البروتين المؤتلف
- الكروماتوغرافيا بالارتباط
الخلفية
- تعد البروتينات المؤتلفة ضرورية للعديد من الدراسات البيوكيميائية.
- يمكن أن تكون طرق التنقية التقليدية مكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً.
- يمكن أن يؤدي الجمع بين العلامات إلى تحسين كفاءة التنقية.
- غالبًا ما تستخدم خلايا الحشرات للتعبير عن البروتينات على مستوى عالٍ.
غرض الدراسة
- لتطوير بروتوكول فعال للغاية لتنقية البروتينات.
- لإنتاج بروتين كامل الطول مثير للاهتمام في شكل قابل للذوبان.
- لتقييم جودة وكمية البروتين المنقى.
الطرق المستخدمة
- إنتاج فيروس bao المؤتلف لتعبر عن البروتين.
- إصابة خلايا الحشرات SF9 لإنتاج البروتينات ذات العلامات.
- تنقيه ثنائي المراحل بالارتباط باستخدام الجلوتاثيون والكروماتوغرافيا بالارتباط المعدني.
- غسل البروتينات المنقىة لتقليل تركيزات الملح.
النتائج الرئيسية
- تنقيه ناجح لبروتين تحمل علامة هستيدين عالية النقاء.
- تقييم التعبير عن البروتين، والقابلية للذوبان، والجودة عبر SDS-PAGE.
- تبرهن على كفاءة طريقة التنقية.
- تشير النتائج إلى إمكانية تطبيق هذه الطريقة على نطاق أوسع في دراسات البروتين.
الاستنتاجات
- البروتوكول المطور فعال وفعال من حيث التكلفة لتنقية البروتينات.
- يعزز الجمع بين GST وعلامات His من نتائج التنقية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من البروتينات المؤتلفة في البحث.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Protein purification remains a critical bottleneck in early-stage target validation, where obtaining full-length, highly pure recombinant proteins is essential for reliable biochemical and functional assays. The GST-His two-step affinity method addresses this challenge by combining orthogonal tags to enrich intact protein species and remove degradation products, thereby improving data quality in downstream screening and mechanistic studies. This approach supports predictive confidence in target validation by reducing false negatives caused by impure or truncated protein preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using full-length proteins, reducing mechanistic ambiguity from proteolytic fragments.
- Operational Value: Provides a cost-effective, small-scale purification workflow compatible with baculovirus expression in insect cells.
- Predictive Value: Increases confidence in assay results by enriching for intact protein species, supporting reliable target engagement and enzymatic readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers highly purified protein suitable for quantitative enzymatic assays and binding studies.
- Operational Value: Eliminates need for expensive FPLC systems, enabling scalable implementation in academic and industrial labs.
- Reproducibility: Dual-tag strategy and cleavage step reduce batch variability from degraded protein contaminants.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Purified full-length proteins support preclinical functional validation and biomarker assay development.
- Mechanistic De-risking: Removal of GST tag after initial purification minimizes potential tag-induced artifacts in functional studies.
- Nucleic Acid & HSP Removal: ATP/MgCl2 washes and nuclease treatment reduce common contaminants that interfere with downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from recombinant protein expression to assay-ready protein supply, enabling reliable transition from target hit confirmation to lead characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing soluble, full-length protein for enzymatic and interaction assays.
- Screening: Produces assay-ready protein with high purity and low salt content after dialysis, suitable for high-concentration screening formats.
- Analytics: Enables clear SDS-PAGE and Western blot analysis to confirm purity, cleavage efficiency, and absence of degradation products.
- Translational Research: Purified protein can be used in preclinical models to validate target function and mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across multiple recombinant proteins, reducing re-optimization effort in protein production pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Full-length protein enrichment improves target validation reliability and reduces false structure-activity relationships.
- Operational Value: Two-step affinity purification increases yield of pure protein while minimizing reagent waste and instrument dependency.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by providing clean biochemical data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage attrition risk by improving target confidence through rigorous protein quality control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in baculovirus production and insect cell culture for recombinant protein expression.
- Dependent on access to glutathione and nickel-affinity resins, protease cleavage enzymes, and standard chromatography equipment.
- Needs standardization of cleavage efficiency and wash conditions across protein targets to ensure consistent tag removal.
- Adaptation may be needed for proteins sensitive to GST tag presence or cleavage conditions.
- Practical limitations include potential incomplete cleavage and residual tag presence, requiring validation via Western blot for each target.
