تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية RNA من عينات جراحية لشبكية العين البشرية لإجراء تحليل الترانسكريبتوم في حالات انفصال الشبكية. ومن خلال اتباع هذا النهج، يتم تحضير الكواشف والمواد اللازمة لجمع العينة الجراحية في المختبر وإرسالها إلى المستشفى. وأثناء العملية الجراحية، يتم جمع العينة وإعادتها إلى المختبر.

يتم بعد ذلك تنقية الـ RNA باستخدام إجراء تدرج كلوريد السيزيوم المعياري، ثم يتم تقييم جودة الـ RNA المنقى. وفي النهاية، يُظهر تحليل تعبير mRNA أن كلاً من الالتهاب وتدهور المستقبلات الضوئية يشاركان في انفصال الشبكية، وهو ما تشير إليه التغيرات في تعبير الجينات الرئيسية. وفي هذه العمليات التي تم تحديدها من خلال التحليل الترانسكريبتومي، تكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بطرق تنقية الـ RNA الحالية مثل استخلاص GTIN chlor، والمعروفة أيضاً باسم ole، في أن الـ RNA الناتج لا يكون ملوثاً بالـ DNA.

يمتد تطبيق هذه التقنية ليشمل علاجات انفصال الشبكية، حيث توفر الوسائل التقنية اللازمة لتطوير علاجات مساعدة جديدة. لكل عينة سيتم جمعها، استخدم ماصة خالية من الـ RNase لملء أنبوب بولي إيثيلين معقم ذو قاع مستدير سعة خمسة ملليلتر بـ 2.4 ملليلتر من محلول كلوريد الغوانيدين بتركيز ستة مولار وخالٍ من الـ RNase. استخدم غاز الأرجون لملء الجزء العلوي من الأنابيب.

ثم ضع الغطاء بسرعة مع الضغط بإحكام لضمان إغلاقه. س يمنع ذلك أكسدة كلوريد الغيني على مدى عدة سنوات من التخزين في خزانة الجراحة. بعد ذلك، ضع كل أنبوب سعة 5 milliliter في أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 50 milliliter ذي قاع مخروطي.

بعد إضافة النسيج وإحكام إغلاق الغطاء، ضع الأنابيب سعة 50 milliliter في حامل من البوليسترين. ثم ضع الحامل والمظاريف المُجهزة إلى جانب نماذج الشحن المُعدة في صندوق كرتوني داخل المستشفى. انقل الصندوق الكرتوني من خزانة الجراحة إلى غرفة الجراحة.

أثناء الجراحة، ضع عينة الشبكية في أنبوب مملوء بـ quantity و chloride solution. أغلق الأنبوب بإحكام، ثم قم برج الأنبوب لفترة وجيزة.

بعد ذلك، ضع الأنبوب على هزاز أنابيب الدم لمدة 10 دقائق. املأ نموذج العينة المرفق ببيانات تعريف المريض وتاريخ الجراحة وأي ملاحظات إضافية. ثم اكتب رقم التعريف على الأنبوب المقابل الذي سعته 50 milliliter.

ثم ضع أنبوب الخمسة ملي لتر الذي يحتوي على العينة الجراحية داخل أنبوب الـ 50 ملي لتر. استبدل المناديل الورقية وأغلق الأنبوب بالغطاء. بعد ذلك، ضع أنبوب الـ 50 ملي لتر ونموذج استلام العينة في المظروف المبطن المناسب ثم أغلقه بإحكام.

بمجرد استلام العينة في المختبر، قم بتجانس العينة في أنبوبها سعة خمسة ملليلتر باستخدام جهاز التجانس poly tron TM على أقصى إعداد لمدة دقيقة واحدة مع تحريك الأنبوب للأعلى والأسفل. وبمجرد تجانس العينة، لاستخلاص السكريات المتعددة، أضف 270 µL من أسيتات البوتاسيوم بتركيز 2 M وضع الأنبوب على جهاز هزاز في وضع أفقي. رج العينة بقوة لمدة 10 دقائق، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,500 G وبدرجة حرارة 20 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، استخدم ماصة لسحب الجزء القابل للذوبان بعناية دون تحريك الراسب. انقل السائل الطافي إلى أنبوب معقم خالٍ من الـ RNA سعة 14 milliliter. أضف إلى السائل الطافي 5.3 milliliters من Laurel Sarcosine بتركيز 1% في 100 millimolar tri، و3.2 grams من cesium chloride.

ستعمل الساركوزين على إذابة الغشاء، بينما يُستخدم كلوريد السيزيوم لإنشاء تدرج. اخلط الأنبوب باستخدام جهاز vortex لمدة دقيقة واحدة. أضف 1.8 milliliters من كلوريد السيزيوم EDTA إلى أنبوب طرد مركزي بوليمري معقم سعة 11 milliliters.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة باستور معقمة سعة 10 milliliter، ضع محلول RNA في طبقة فوق محلول cesium chloride EDTA عن طريق تركه ينزلق على السطح الداخلي للأنبوب. ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي. استخدم أنبوباً ثانياً يحتوي على المحاليل المنظمة بدون retina كموازن إذا لزم الأمر، ثم قم بالدوران لمدة 24 ساعة بسرعة 225, 000 G عند درجة حرارة 20 degrees Celsius.

في اليوم التالي. بعد عملية الطرد المركزي، ستتكون طبقة دهنية عند أعلى الأنبوب. وسيكون الـ DNA في المنتصف بينما يترسب الـ RNA في أسفل الأنبوب.

استخدم ماصة باستير معقمة لإزالة الطبقة الدهنية العلوية بعناية والتخلص منها باستخدام ماصة باستير معقمة ثانية. قم بإزالة المحلول تدريجياً حتى يتم سحب الحمض النووي (DNA) اللزج. تخلص من المحلول والحمض النووي (DNA).

بعد ذلك، وباستخدام ماصة باستور معقمة ثالثة، قم بإزالة المحلول المتبقي والتخلص منه، مع الحرص على عدم تحريك كتلة الـ RNA. الآن، وباستخدام مشرط معقم باللهب، اقطع الأنبوب كما هو موضح هنا وتخلص من الجزء العلوي.

ضع الجزء المتبقي مقلوباً على شاش معقم. اقلب الأنبوب واستخدم ماصة لشطفه بدقة باستخدام 160 µL من guine chloride. اترك الراسب ليجف لمدة 10 دقائق.

بمجرد جفاف الراسب، يتم إعادة تعليقه في 150 µL من محلول tris-EDTA-SDS. بعد ذلك، أضف 150 µL من محلول tris-EDTA و 30 µL من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 M، ثم استخدم جهاز هزاز الرؤوس (vortex) لترسيب الـ RNA. أضف 900 µL من الإيثانول 100% المبرد بالثلج.

قم برج الأنبوب بجهاز المزج الدوامي (Vortex) وضعه على ثلج منصهر لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة 30 دقيقة بسرعة 18,000 G عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد انتهاء عملية الطرد المركزي، قد تظهر أو لا تظهر كريّة بيضاء صغيرة في قاع الأنبوب.

سواء كانت الراسبة مرئية أم لا، قم بسحب السائل الطافي بدقة وتخلص منه. ثم لإزالة الملح الزائد، أضف 500 µL من الإيثانول بتركيز 70% في درجة حرارة الغرفة وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس، ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي للأنبوبة لمدة 20 دقيقة عند 18,000 G في درجة حرارة 4 °C. وبعد تكرار عملية الغسل بالإيثانول بتركيز 70% والطرد المركزي، استخدم ماصة P 200 لإزالة أي إيثانول متبقٍ.

اترك الراسب ليجف في الهواء لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الراسب في 50 µL من الماء المعالج بالـ dey وامزجه بقوة باستخدام جهاز الـ vortex لمدة دقيقتين. بعد ذلك، ضع العينة في حمام مائي بدرجة حرارة 45 °C لمدة 15 دقيقة.

لإعادة تعليق الـ RNA بالكامل. وأخيراً، يتم تحديد تركيز الـ RNA عن طريق الامتصاص عند 260 nanometers وتحليل الـ RNA بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام وفقاً للبروتوكول. وفي الوثيقة المرفقة، ومن أجل فحص النسخ المتنقل (transcriptome) لانفصال الشبكية، تم استخدام إجراء المجلة لاستعادة وتحليل الـ RNA الشبكي من 18 مريضاً يعانون من انفصال الشبكية و18 شخصاً من مجموعة الضبط متطابقين في العمر تم إعدادهم باستخدام شبكيات ما بعد الوفاة.

تَمَّت تنقية الـ RNA لاحقاً وتحليله باستخدام الفصل الكهربائي للهلام (gel electrophoresis) وrettino base كما هو موصوف في هذا التقرير؛ وتظهر هنا الرسوم البيانية الرادارية التي تمثل تعبير جين CCL two الخاص بجذب الخلايا الوحيدة (monocyte chemotactic M CP one). يمثل الجزء الأيمن من الشكل المسمى RD الـ RNA المستخلص من مرضى انفصال الشبكية، بينما يمثل الجزء الأيسر المسمى N الـ RNA من مجموعات الضبط كما هو موضح هنا. يؤدي انفصال الشبكية إلى زيادة تنظيم تعبير CCL two، وهو ما تشير إليه قيم C المرتفعة في معظم عينات RD على اليمين مقارنة بعينات الضبط على اليسار.

تشير هذه الزيادة إلى وجود التهاب لدى المرضى الذين يعانون من انفصال الشبكية كما هو موضح هنا. وعلى العكس من CCL two، انخفض تعبير جين GNAT one المسؤول عن نقل الإشارة في المستقبلات الضوئية العصوية، حيث تظهر القيم منخفضة لعينات RD على اليمين، كما لوحظ انخفاض في تعبير أوبسين المخاريط قصير الموجة O PN one SW، والجين المنزلي CRX، مما يشير إلى تنكس المستقبلات الضوئية من العصويات والمخاريط معاً لدى المرضى المصابين بانفصال الشبكية. ومن خلال هذه الطريقة، يمكن الحصول على رؤى حول تغيرات التعبير الجيني التي تلي انفصال الشبكية، كما يمكن تطبيقها على أمراض شبكية أخرى في النماذج الحيوانية، مثل حالات تنكس الشبكية الوراثي.

قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنها تتطلب معرفة بالأحماض النووية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية كمرجع، حيث أن التعامل مع RNA بعد الاعتماد يكون معقداً.