تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة
أغسطس 14, 2013
استخدمنا عينات من شبكية العين retinectomy لتحليل transcriptomic من انفصال الشبكية. وضعنا الداخلي الذي يسمح بحفظ RNA بين الكتل الجراحية والمختبرية. نحن موحدة بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي التي كتبها السيزيوم كلوريد تنبيذ فائق للتأكد من أن الرنا المنقى هي مناسبة لتحليل ميكروأري.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية الحمض النووي الريبي من العينات الجراحية للشبكية البشرية لتحليل النسخ في انفصال الشبكية. باستخدام مجلة للقيام بذلك ، يتم تحضير الكواشف والمواد اللازمة لجمع العينة الجراحية في المختبر وإرسالها إلى المستشفى. أثناء العملية الجراحية ، يتم جمع العينة وإعادتها إلى المختبر.
ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام إجراء تدرج كلوريد السيزيوم الموحد ويتم تقييم جودة الحمض النووي الريبي المنقى. في النهاية. يظهر تحليل تعبير mRNA أن كلا من الالتهاب وتنكس المستقبلات الضوئية متورطان في انفصال الشبكية المشار إليه من خلال التغيرات في التعبير عن الجينات الرئيسية. في هذه العمليات التي تم تحديدها بواسطة التحليل النسخي ، فإن الميزة الرئيسية للمجلة على تنقية أورنا الموجودة مثل كلور GTIN من الاستخراج ، والمعروف أيضا باسم أولي ، هي نتيجة عدم تلوث الشفرية بالحمض النووي.
يمتد تطبيق هذه التقنية إلى علاجات انفصال الشبكية لأنها توفر وسائل تقنية لتطوير علاجات مساعدة جديدة. لكل عينة يتم جمعها ، استخدم ماصة خالية من الحمض النووي الريبي لملء أنبوب دائري دائري من البولي إيثيلين معقم سعة خمسة ملليلتر ب 2.4 مل من محلول كلوريد غين خال من ستة مليات من الحمض النووي الريبي. استخدم غاز الأرجون لملء الجزء العلوي من الأنابيب.
ثم ضع الغطاء بسرعة مع الضغط بإحكام للتأكد من إغلاقه. سيمنع ذلك أكسدة كلوريد غينيا على مدى عدة سنوات من التخزين في الخزانة الجراحية. بعد ذلك ، ضع كل أنبوب من الأنابيب المليلتر الخمسة في أنبوب سفلي مخروطي معقم سعة 50 مل.
بعد إضافة منديل ورقي وشد الغطاء ، ضع الأنابيب سعة 50 مليلتر في رف البوليسترين. ثم ضع الرف والمغلفات المعدة مع نماذج الشحن المعدة في صندوق من الورق المقوى في المستشفى. أحضر صندوق الورق المقوى من الخزانة الجراحية إلى غرفة الجراحة.
أثناء الجراحة ، ضع عينة الشبكية في أنبوب مملوء بالكمية ومحلول الكلوريد. أغلق الأنبوب بإحكام. امزج الأنبوب لفترة وجيزة.
ثم ضع الأنبوب على هزاز أنبوب الدم لمدة 10 دقائق. املأ نموذج العينة المرفق بتاريخ جراحة تحديد هوية المريض وأي ملاحظات إضافية. ثم اكتب رقم التعريف على أنبوب 50 مليلتر المرقم المقابل.
ثم ضع الأنبوب المكون من خمسة ملليلتر مع العينة الجراحية في أنبوب سعة 50 ملليلترا. استبدل المناديل الورقية وقم بتغطية الأنبوب. ثم ضع الأنبوب سعة 50 مليلتر ونموذج تناول العينة في المغلف المبطن المناسب وأغلقه.
بمجرد استلام العينة في المختبر ، قم بتجانس العينة في أنبوبها الذي يبلغ وزنه خمسة ملليلتر باستخدام الخالط بولي ترون TM بأقصى إعداد لمدة دقيقة واحدة أثناء تحريك الأنبوب لأعلى ولأسفل. بمجرد تجانس العينة ، لاستخراج السكريات ، أضف 270 ميكرولترا من أسيتات البوتاسيوم المولية وضع الأنبوب على شاكر في الوضع الأفقي. رج العبوة بقوة لمدة 10 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6،500 جم عند 20 درجة مئوية.
بعد الدوران ، استخدم ماصة لشفط الجزء القابل للذوبان بعناية دون إزعاج الحبيبات. انقل المادة الطافية إلى أنبوب خال من الحمض النووي الريبي المعقم سعة 14 مل. بجانب المادة الطافية ، أضف 5.3 مل من 1٪ و Laurel Sarcosine في 100 ، مليمولار ثلاثي ، و 3.2 جرام من كلوريد السيزيوم.
سيعمل الساركوزين على إذابة الغشاء ويستخدم كلوريد السيزيوم لتوليد تدرج. امزج الأنبوب عن طريق الدوامة لمدة دقيقة واحدة. أضف 1.8 مل من كلوريد السيزيوم EDTA إلى أنبوب طرد مركزي بوليمر معقم سعة 11 مل.
ثم باستخدام ماصة القس المعقمة سعة 10 ملليلتر ، ضع طبقة من محلول الحمض النووي الريبي على محلول EDTA من كلوريد السيزيوم عن طريق السماح له بالجري على السطح الداخلي للأنبوب. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي. استخدم أنبوبا ثانيا يحتوي على المخازن المؤقتة بدون شبكية العين كتوازن إذا لزم الأمر ، وقم بالدوران لمدة 24 ساعة عند 225،000 جم عند 20 درجة مئوية.
في اليوم التالي. بعد الدوران ، ستتشكل طبقة دهنية في الجزء العلوي من الأنبوب. سيكون الحمض النووي في المنتصف وسيتم تكوير الحمض النووي الريبي في الجزء السفلي من الأنبوب.
استخدم ماصة معقمة لإزالة الطبقة الدهنية العليا والتخلص منها بعناية باستخدام ماصة معقمة ثانية. قم بإزالة المحلول تدريجيا حتى يتم شفط الحمض النووي اللزج. تجاهل المحلول والحمض النووي.
ثم باستخدام ماصة القس المعقمة الثالثة ، قم بإزالة المحلول المتبقي والتخلص منه. الحرص على عدم إزعاج حبيبات الحمض النووي الريبي. الآن باستخدام مشرط معقم باللهب ، قم بقص الأنبوب كما هو موضح هنا وتخلص من الجزء العلوي.
ضع الجزء المتبقي رأسا على عقب على شاش معقم. اقلب الأنبوب واستخدم ماصة لشطفه بدقة باستخدام 160 ميكرولتر من كلوريد الغين. دع الحبيبات تجف لمدة 10 دقائق.
بمجرد أن تجف الحبيبات ، يتم تعليقها في 150 ميكرولتر من تريس ، E-D-T-A-S-D-S. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من tris و EDTA و 30 ميكرولترا من أسيتات الصوديوم الثلاثة مولية ، ثم الدوامة لترسيب الحمض النووي الريبي. أضف 900 ميكرولتر من المثلج البارد ، 100٪ الإيثانول.
قمبتدوير الأنبوب وضعه على الجليد الذائب لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 دقيقة عند 18،000 جم عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، قد تكون حبيبات بيضاء صغيرة مرئية وقد لا تكون مرئية.
سواء كان من الممكن رؤية الحبيبات أم لا ، استنشق المادة الطافية بدقة وتخلص منها. ثم لإزالة الملح الزائد ، أضف 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة ، و 70٪ من الإيثانول والدوامة ، وجهاز الطرد المركزي الأنبوبي ، والأنبوب لمدة 20 دقيقة عند 18 ، 000 جم عند أربع درجات مئوية. بعد تكرار غسل الإيثانول وتدويره بنسبة 70٪ ، استخدم ماصة P 200 لإزالة أي إيثانول متبقي.
دع الحبيبات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من الماء المعالج بقوة عن طريق الدوامة لمدة دقيقتين. ثم ضع العينة في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي بالكامل. أخيرا ، حدد تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر وقم بتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وفقا للبروتوكول. في الوثيقة المصاحبة ، لفحص نسخ انفصال الشبكية ، تم استخدام إجراء المجلة لاستعادة وتحليل الحمض النووي الريبي للشبكية من 18 مريضا يعانون من انفصال الشبكية و 18 ضابطا متطابقا مع العمر تم إعدادهم باستخدام شبكية العين بعد الوفاة.
تم تنقية الحمض النووي الريبي لاحقا وتحليله باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام وقاعدة الريتينو كما هو موضح في هذا التقرير الموضح هنا عبارة عن رسوم بيانية رادارية تمثل تعبير الخلايا الأحادية الكيميائية M CP جين واحد CCL اثنين. يتوافق الجزء الأيمن من الشكل المسمى RD مع الحمض النووي الريبي من مرضى انفصال الشبكية ، في حين أن الجزء الأيسر المسمى N هو الحمض النووي الريبي من الضوابط كما يتضح هنا. ينتج عن انفصال الشبكية تنظيم CCL الثاني كما يتضح من قيم C العالية في معظم عينات RD على اليمين مقارنة بتلك الموجودة في الضوابط على اليسار.
تشير هذه الزيادة إلى التهاب لدى المرضى الذين يعانون من انفصال الشبكية كما يتضح هنا. تم تقليل التعبير عن جين مستقبلات ضوئية القضيب GNAT واحد على النقيض من CCL الثاني ، والقيم منخفضة لعينات RD على اليمين ، وانخفاض في التعبير عن مخروط الموجة القصيرة opsin O PN واحد SW ، ولوحظ أيضا أن الجين المتماثل CRX يشير إلى تنكس المستقبلات الضوئية لكل من القضبان والأقماع في المرضى الذين يعانون من انفصال الشبكية من خلال هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتغيرات التعبير الجيني بعد انفصال الشبكية. يمكن تطبيقه أيضا على أمراض الشبكية الأخرى في النماذج الحيوانية مثل تنكس الشبكية الوراثي.
قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب معرفة بالحمض النووي. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية كحل ، والذي يكون الحمض النووي الريبي بعد الشهادة صعبا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تركز هذه الدراسة على تنقية الحمض النووي الريبي من عينات جراحية لشبكية العين البشرية لتحليل النسخ في حالات انفصال الشبكية. يتم استخدام إجراء معياري لتركيز كلوريد السيزيوم لضمان جودة الحمض النووي الريبي لتحليل إضافي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الشبكية
- النسخية
الخلفية
- يمكن أن يؤدي انفصال الشبكية إلى فقدان كبير في الرؤية.
- فهم تغيرات التعبير الجيني ضروري لتطوير استراتيجيات علاجية.
- جودة الحمض النووي الريبي ضرورية لتحليل نسخ دقيق.
- قد تؤدي طرق تنقية الحمض النووي الريبي الموجودة إلى التلوث.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لتنقية الحمض النووي الريبي من عينات الشبكية.
- تحليل التعبير الجيني المرتبط بانفصال الشبكية.
- لتقييم مشاركة الالتهاب وتدهور المستقبلات الضوئية.
الطرق المستخدمة
- جمع عينات الشبكية أثناء استئصال الشبكية.
- تحضير الكواشف والمواد اللازمة لاستخراج الحمض النووي الريبي.
- إجراء معياري لتركيز كلوريد السيزيوم لتنقية الحمض النووي الريبي.
- تقييم جودة الحمض النووي الريبي لتحليل المصفوفات الدقيقة.
النتائج الرئيسية
- تحديد تغيرات التعبير الجيني الرئيسية المرتبطة بانفصال الشبكية.
- أدلة على الالتهاب وتدهور المستقبلات الضوئية في التحليل النسخي.
- الدليل على أن الطريقة الجديدة تمنع تلوث الحمض النووي الريبي.
- تحسين جودة الحمض النووي الريبي المناسبة لتحليل المصفوفات الدقيقة.
الاستنتاجات
- طريقة تنقية الحمض النووي الريبي المطورة فعالة لعينات الشبكية.
- يوفر التحليل النسخي رؤى حول آليات انفصال الشبكية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة لمزيد من البحث في أمراض الشبكية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Retinal detachment triggers concurrent inflammation and photoreceptor degeneration, creating a complex pathophysiological environment that complicates therapeutic development. The jouRNAl method enables high-fidelity transcriptomic profiling of surgically discarded human retinal specimens, providing a scalable source of disease-relevant tissue for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by linking molecular signatures to clinical phenotypes, informing go/no-go decisions in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous detection of inflammatory and degenerative pathways in human retinal tissue.
- Operational Value: Transforms discarded surgical specimens into validated biological systems, reducing reliance on animal models for early target assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing human-derived expression data on CCL2, GNAT1, OPN1SW, and CRX as biomarkers of RD progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers DNA-free RNA suitable for microarray and RT-PCR, ensuring assay specificity for gene expression readouts.
- Operational Value: Standardized cesium chloride gradient protocol ensures reproducibility across batches and sites, enabling scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified RNA quality validated by gel electrophoresis and absorbance, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by using human retinal specimens to validate findings in animal models of inherited retinal degeneration.
- Biomarker Alignment: Identifies CCL2 upregulation and photoreceptor gene downregulation as translatable signatures for therapeutic monitoring.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic insight into RD progression, informing biomarker-stratified clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The jouRNAl method integrates into the discovery continuum from early target identification through preclinical validation, enabling human tissue-based de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inflammation and degeneration pathways via transcriptomic analysis of human retinal specimens.
- Screening: Delivers standardized, quantitative RNA outputs suitable for high-throughput gene expression profiling.
- Analytics: Generates measurable readouts (e.g., CCL2 upregulation, GNAT1 downregulation) that allow cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects human specimen data to preclinical continuity by enabling comparative analysis in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA extraction from surgical tissues, applicable across retinal pathologies and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct human tissue transcriptomics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cesium chloride purification, minimizing batch variability in multi-site studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-derived molecular evidence, reducing late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concurrent inflammation and degeneration signatures in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and gradient ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to cesium chloride, ultracentrifuges, and RNase-free laboratory infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, pathology, and molecular biology units for specimen tracking.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of homogenization and lysis steps.
- Practical limitation: RNA yield depends on timely specimen transfer and avoidance of RNase exposure during surgical collection.
