تقنيات لمعالجة العيون تزرع لهم تعويضات الشبكية لتحليل المرضية المترجمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين تقييم سلامة الأطراف الاصطناعية للشبكية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وسم سطح عين مستأصلة ومثبتة بشكل مثالي باستخدام صبغات أنسجة للإشارة إلى موقع القطب الكهربائي المزروع. وفي الخطوة الثانية، يتم إزالة مصفوفة القطب الكهربائي وتشريح أنسجة العين إلى شرائح.

بعد ذلك، يتم تثبيت الشرائح في الآغار ثم تُطمر في البارافين. وفي الخطوة النهائية، يتم تقطيع المناطق المحددة ذات الأهمية وجمعها على شرائح زجاجية لصبغها. وفي النهاية، يمكن تقييم الحالة الصحية للمناطق المزروعة المجاورة لكل قطب كهربائي باستخدام مجهر المجال المضيء ومجهر التألق المناعي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تقليل العيوب الناتجة عن التثبيت وانفصال الطبقات، بينما يمكن تتبع مناطق الأنسجة المجاورة للقطب الكهربائي بدقة في العينات الكبيرة. كما يمكن استخدامها في تقييم سلامة الغرسات الجديدة لأمراض العين الأخرى. وبشكل عام، سيجد الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة أنها صعبة لأن الشبكية عرضة لانفصال الطبقات، كما أنها تتطلب مستوى عالٍ من المهارة اليدوية في التعامل مع العينات.

يعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة أمراً هاماً لأن تعليم كيفية وضع العلامات والتعامل مع الأنسجة الهشة يمثل صعوبة. قبل هذه الدراسة، وبعد الزرع بمصفوفة أقطاب كهربائية فوق المشيمية، تمت معالجة العيون سابقاً باستخدام تقنية غير مثالية كما تشير النجمة. تظهر هذه الصورة الأولى مقطعاً متعامداً نموذجياً عبر تجويف مصفوفة الأقطاب الكهربائية.

لاحظ أن الشبكية منفصلة عن أنسجة العين الخارجية. ويتضح هذا بشكل خاص أسفل المنطقة المزروعة كما يشير رأس السهم. لاحظ أيضاً أنه من غير الممكن تحديد أي جزء من الشبكية كان مجاوراً لكل قطب كهربائي فردي في المصفوفة.

في هذا التكبير العالي، تظهر عدة شوائب ناتجة عن عملية التحرير في طبقات الشبكية كما تشير رؤوس السهام، بالإضافة إلى انفصال كبير في طبقة الطوربيد، وهي الطبقة العاكسة في عين القطط. وعند زيادة التكبير، يمكن ملاحظة أن القطع الخارجية للمستقبلات الضوئية، وكذلك الظهارة الصبغية، ظلت سليمة، مما يشير إلى أن الانفصالات الملاحظة سابقاً كانت آثاراً جانبية اصطناعية ناتجة عن المعالجة بدلاً من كونها ناتجة عن صدمة أو مرض في الجسم الحي. وبناءً على ذلك، تم تطبيق التقنية التالية لتقليل هذه الشوائب والانفصالات الطبقية المرتبطة بالتثبيت.

بعد إجراء عملية التنوي وعملية التثبيت، ابدأ بإخراج مقلة العين المزروعة من الإيثانول وتشذيب الأنسجة الزائدة بعناية، بما في ذلك الملتحمة ومحفظة الوتر. قم بتشذيب العصب البصري ليصل طوله إلى 2 إلى 3 مليمتر. تكون مصفوفة الأقطاب الكهربائية مرئية من خلال الصلبة شبه الشفافة.

بعد ذلك، استخدم فرشاة رسم ذات سن رفيع لتطبيق الأصباغ النسيجية بعناية على النسيج لتمييز الأقطاب الكهربائية وفقاً لترميز لوني محدد مسبقاً، مع الحرص على عدم تلطيخ الصبغة. ويمكن وضع علامات إضافية بالصبغة لتحديد نقاط الاهتمام أو للمساعدة في محاذاة المقاطع.

هنا، تم تمييز الأقطاب الكهربائية ذات التحفيز الأقصى باللون الأخضر. وتم تمييز الأقطاب الكهربائية النشطة الأخرى باللون الأحمر. أما أقطاب العودة ذات القطر الأكبر فقد لُوِّنَت باللون الأصفر، بينما تم تمييز أي أدلة إضافية أو علامات تشريحية بصبغة زرقاء.

بعد خمس دقائق من التجفيف بالهواء، أعد المقلة إلى الإيثانول بتركيز 70% لتجفيف الصبغة. ثم بعد تقليم الأنسجة الزائدة من مقلة العين الضابطة غير المزروعة كما تم توضيحه للتو، استخدم الغرز الثماني النايلونية التي تم تثبيتها خلال خطوة إزالة النواة والتثبيت لمحاذاة العين الضابطة والعين المزروعة كزوج متماثل. بعد ذلك، ضع قالبًا من السيليكون بنفس أبعاد مصفوفة الأقطاب الكهربائية في موقع مماثل على العين الضابطة يقابل موقع المصفوفة في العين المزروعة.

ثم قم بتمييز مقلة العين الضابطة كما تم توضيحه للتو، بحيث يكون لكل موقع قطب كهربائي مزروع زوج ضابط في موقع مماثل تشريحيًا. بعد ذلك، قم بإزالة مصفوفة الغرسة من العين ثم أزل الجزء الأمامي من العين، بما في ذلك القرنية والقزحية والعدسة. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الزجاجي من تجويف العين المتبقي.

قم الآن بتشريح العين المزروعة إلى عدة شرائح بسمك 2 mm لكل منها، بحيث تحتوي كل شريحة على مجموعة فرعية من المناطق المحددة بالقالب. يجب اختيار اتجاه الشرائح للمساعدة في تقييم الجوانب المختلفة لاستجابة الأنسجة للغرسة، مع توثيق موقع علامات القالب على العينات بدقة للرجوع إليها مستقبلاً.

بعد ذلك، ضع الشريط بحيث يكون الجانب المراد قطعه أولاً متجهاً للأسفل في حوض ضحل من الآغار المسال. وبمجرد أن يتصلب الآغار، قم بالقص حول العينة وضعها في كاسيت أنسجة مدعوم بقطع إسفنجية. وبعد تشريح وتضمين العين الضابطة، ضع الكاسيتات في فورمالين منظم متعادل وعالجها طوال الليل باستخدام تقنية معالجة البارافين الآلية القياسية لمدة 12 hour.

في اليوم التالي، يتم طمر النسيج المعالج في البارافين مع توجيه الجانب المراد قطعه أولاً إلى الأسفل. بعد ذلك، تقطع كتل البارافين إلى مقاطع بسمك خمس ميكرون. ثم يتم تثبيت المقاطع المأخوذة من كل منطقة من المناطق المصبوغة على شرائح زجاجية.

من أجل تحديد موقع منطقة DY، افحص الشرائح بانتظام تحت المجهر. ستكون المناطق المجاورة مباشرة لكل بقعة مصبوغة في الصلبة هي تلك التي كانت الأكثر قرباً من القطب الكهربائي المقابل من المصفوفة. وأخيراً، قم بصبغ المقاطع حسب الرغبة.

نطاق ديناميكي عالٍ. تظهر الصور الماكرو لعين قطة مستأصلة مع مصفوفة أقطاب كهربائية فوق المشيمية في موضعها بعد التثبيت باستخدام مثبت ديفيدسون (davidson's fixative) وقبل إزالة المصفوفة. تسمح الصلبة الشفافة برؤية الأقطاب الكهربائية الفردية في المصفوفة.

كما هو موضح برأس السهم، يتم تمييز الأقطاب الكهربائية بمخطط ألوان صبغية محدد مسبقاً. تُستخدم علامات الصبغة هذه، الموزعة بمسافات منتظمة من المعالم التشريحية، للحفاظ على الاتساق عبر التجارب المختلفة. وعند إزالة مصفوفة الأقطاب الكهربائية، يتم تشريح العين يدوياً إلى شرائح عينية.

تشير رؤوس السهام إلى موقعين من المواقع المجاورة للقطب الكهربائي على الصلبة. يشير الخط المتقطع إلى مستوى القطع في هذا المقطع التمثيلي الذي تم الحصول عليه من قطع العينة الموضحة في الشكل السابق، حيث تم الحفاظ على الشكل العام لشريحة العينة مع الحد الأدنى من القطع النسيجية التفاضلية. لا تزال كلتا علامتي الصبغة مرئيتين على الصلبة كما تشير رؤوس السهام.

على الرغم من أن الصبغة الخضراء كانت أكثر صموداً من الحمراء، إلا أن موقع الصبغة يشير إلى موضع القطب الكهربائي. وبناءً على ذلك، يمكن تقييم أنسجة الشبكية المجاورة للتأكد من وجود أي ضرر، إن وجد، ناتج عن التحفيز الكهربائي؛ وكما يظهر عند هذا التكبير، لم تكن طبقات الشبكية المجاورة للصبغة الخضراء الظاهرة في الصورة السابقة منفصلة فعلياً، وقد تم الحفاظ على مورفولوجيا الشبكية هنا. تظهر في هذه الصورة الأولى عينات ممثلة للتلوين الخاص والكيمياء النسيجية المناعية لمقاطع أنسجة الشبكية التي تمت معالجتها وفقاً للبروتوكول الحالي.

صبغ الهيماتين نويات الخلايا باللون الأزرق، بينما صبغ الإيوسين سيتوبلازم الخلايا والكولاجين والأنسجة الداعمة بظلال مختلفة من اللون الوردي. في هذه الصورة، صبغ اللون الأزرق السريع لوكسال الميالين باللون الأزرق. واستُخدم صبغ كريسيتال البنفسجي كصبغة مقابلة لتحديد الخلايا العقدية عن طريق صبغ أجسام ميسيل داخل اللون الأزرق المحيطي ومن خلال إبراز الخلايا الساتلية المحيطة. في هذا المقطع المعالج بصبغة ماسون ثلاثية اللون، صبغ محلول حمض بريك القرمزي المدمج الألياف العضلية باللون الأحمر، بينما صبغ اللون الأزرق الليني الكولاجين.

في هذه الحالة، تم صبغ الصلبة باللون الأزرق في هذا المقطع باستخدام صبغة حمض دوريك شيف، حيث تظهر مكونات البروتين السكري للغشاء القاعدي ومكونات النسيج الضام باللون الأرجواني، بينما تظهر نوى الخلايا باللون الأزرق نتيجة الصبغ المضاد بالهيماتوكيسين. وقد عُولج المقطع تحت الصلبة الموضح في هذه الصورة بصبغة بيرلز الزرقاء البروسية في موقع النزيف. وقد أدى تكوين الهيموسيدرين من خلايا الدم الحمراء المتحللة وإطلاق مركبات الحديد إلى إنتاج لون أرجواني.

أدى إضافة صبغة الأحمر المحايد إلى تلوين الليزوزومات باللون الأحمر في هذه الصورة، بينما صُبغ إنزيم glutamine Synthetase. يمتد هذا الإنزيم المحلل للنواقل العصبية، والموجود في خلايا مولر (Mueller cells) باللون الأخضر، في كلا الاتجاهين مع أجسام خلايا مولر ضمن الطبقة النووية الداخلية ونهايات خلايا مولر التي تشكل الغشاء المحدد الداخلي. وبالنسبة لصبغ بروتين الخيوط العصبية (neurofilament protein)، فقد وُسم هذا البروتين الهيكلي ذو السلسلة الثقيلة باللون الأخضر ووُجد في جسم الخلية واستطالاتها؛ حيث يتشابك بروتين الخيوط العصبية مع خيوط عصبية أخرى للحفاظ على بنية العصبونات.

يمكن ملاحظة الخلايا العقدية ومحاويرها في طبقتي الخلايا العقدية والألياف العصبية، بينما تظهر محاوير الخلايا الأفقية الواقعة عند الحدود الخارجية للطبقة النووية الداخلية في شبكية عين القط باللون الأخضر. وفي هذه الصورة النهائية، يظهر البروتين الحمضي الليفي الدبقي، وهو بروتين هيكلي خلوي يظهر باللون الأحمر، يتكاثر في خلايا Mueller والخلايا النجمية أثناء الدباق، ويمكن رؤيته وهو يبطن طبقة الألياف العصبية مع تشكيل خلايا Mueller لامتدادات رفيعة عبر الطبقات الشبكية من الداخلية إلى الخارجية. ويسمح التلوين المضاد باستخدام DPI باللون الأزرق بتصور طبقات الشبكية.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تصور سير عمل العينة في ثلاثة أبعاد ومراعاة اتجاه العينات بانتظام طوال مراحل الإجراء. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام جميع الطرق النسيجية للإجابة على أسئلة إضافية متعلقة بالسلامة بعد مرحلة التطوير. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في تطوير العين البيونية لتقييم مستويات التحفيز الآمنة على المدى الطويل للمرضى المكفوفين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم سلامة غرسة العين الإلكترونية.