تقنيات لمعالجة العيون تزرع لهم تعويضات الشبكية لتحليل المرضية المترجمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين تقييم سلامة الشبكية الاصطناعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات أولا على سطح العين المنزوعة النواة الثابتة على النحو الأمثل بأصباغ الأنسجة للإشارة إلى موضع القطب المزروع. في الخطوة الثانية ، تتم إزالة مصفوفة الأقطاب الكهربائية وتشريح أنسجة العين إلى شرائح.

بعد ذلك ، يتم تثبيت الشرائط في أجار ثم يتم دمجها في البارافين. في الخطوة الأخيرة ، يتم تقسيم مناطق الاهتمام المحددة وجمعها على شرائح للتلطيخ. في النهاية ، يمكن تقييم صحة المناطق المزروعة المجاورة لكل قطب كهربائي عن طريق المجهر الساطع والفلوري المناعي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقليل القطع الأثرية والتفريغ المرتبط بالتثبيت بينما يمكن تتبع مناطق الأنسجة المجاورة للقطب الكهربائي بدقة في عينات كبيرة. يمكن استخدامه أيضا في تقييم سلامة الغرسات الجديدة لأمراض العيون الأخرى. بشكل عام ، سيجد الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن شبكية العين عرضة للتفريغ ومطلوب مستوى عال من البراعة للتعامل مع العينات.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما لأنه يصعب تعلم وضع علامات على الأنسجة الهشة والتعامل معها. قبل هذه الدراسة ، بعد الزرع بمجموعة قطب كهربائي فوق المحور ، تمت معالجة العيون مسبقا باستخدام تقنية غير مثالية كما هو موضح من قبل النجم. تظهر هذه الصورة الأولى قسما متعامدا تمثيليا من خلال تجويف مصفوفة القطب الكهربائي.

لاحظ أن شبكية العين منفصلة عن أنسجة العين الخارجية. يتضح هذا بشكل خاص تحت المنطقة المزروعة كما هو موضح في رأس السهم. لاحظ أيضا أنه لا يمكن تحديد أي جزء من شبكية العين كان مجاورا لكل قطب كهربائي فردي من المصفوفة.

في هذا التكبير العالي ، هناك العديد من القطع الأثرية القائمة على الإطلاق المنتظم في طبقات الشبكية كما هو موضح في رؤوس الأسهم ، بالإضافة إلى انفصال كبير عن طبقة الطوربيد ، الطبقة العاكسة في عين القطط. عند مزيد من التكبير ، يمكن ملاحظة أن الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية ، وكذلك الظهارة المصطبغة ، تظل سليمة ، مما يشير إلى أن الانفصالات التي لوحظت سابقا أو الآثار الجانبية المصطنعة للمعالجة بدلا من الناتجة عن الصدمة أو علم الأمراض في الجسم الحي. وبالتالي ، تم تنفيذ التقنية التالية لتقليل هذه القطع الأثرية المتعلقة بالتثبيت والتفريغ.

بعد النواة وتثبيت العينين ، ابدأ بإزالة كرة العين المزروعة من الإيثانول وتقليم الأنسجة الزائدة بعناية ، بما في ذلك الملتحمة وكبسولة الأوتار. تقليم العصب البصري بطول ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات. يمكن رؤية مصفوفة الأقطاب الكهربائية من خلال الصلبة شبه الشفافة.

ثم استخدم فرشاة رسم ذات رؤوس دقيقة لتطبيق الأصباغ النسيجية بعناية على الأنسجة لتسمية الأقطاب الكهربائية برمز لون محدد مسبقا. الحرص على عدم تلطيخ الصبغة. يمكن عمل علامات صبغة إضافية لتحديد نقاط الاهتمام أو المساعدة في محاذاة الأقسام.

هنا ، تم تمييز الأقطاب الكهربائية المحفزة إلى أقصى حد باللون الأخضر. تم تصنيف الأقطاب الكهربائية النشطة الأخرى باللون الأحمر. تم تلوين أقطاب الإرجاع ذات القطر الأكبر باللون الأصفر ، وتم تصنيف أي أدلة إضافية أو علامات تشريحية بصبغة زرقاء.

بعد خمس دقائق من التجفيف بالهواء ، أعد الكرة الأرضية إلى 70٪ من الإيثانول لتجفيف الصبغة. ثم بعد تقليم الأنسجة الزائدة من كرة العين غير المزروعة كما هو موضح للتو ، استخدم خيوط النايلون الثمانية المرفقة أثناء خطوة التنوي والتثبيت لمحاذاة التحكم والعيون المزروعة كزوج معكوس. ثم ضع قالب سيليكون بنفس أبعاد مصفوفة الأقطاب الكهربائية على موقع معكوس على عنصر التحكم I المقابل لموقع المصفوفة في العين المزروعة.

ثم قم بتسمية كرة التحكم كما هو موضح للتو بحيث يكون لكل موقع قطب كهربائي مزروع زوج تحكم في موقع قابل للمقارنة تشريحيا. بعد ذلك ، قم بإزالة مجموعة الغرسات من العين ثم قم بإزالة الجزء الأمامي من العين ، بما في ذلك القرنية والقزحية والعدسة. بعد ذلك ، قم بإزالة السائل الزجاجي من كوب العين المتبقي.

الآن قم بتشريح العين المزروعة إلى عدة شرائط بسمك ملليمترين. يحتوي كل منها على مجموعة فرعية من المناطق التي تم وضع علامة عليها. يجب اختيار اتجاه الشرائط للمساعدة في تقييم الجوانب المختلفة لاستجابة الأنسجة للزرع ، وتوثيق موضع علامات القالب على العينات بعناية للرجوع إليها في المستقبل.

بعد ذلك ، ضع الشريط بحيث يكون الجانب المراد قطعه متجها أولا لأسفل في بركة ضحلة من أجار المسال. بمجرد أن يتماسك الأجار ، قم بقص العينة وضعها في علبة مناديل مدعومة بإدخالات رغوية. بعد تشريح عين التحكم وتضمينها ، ضع الكاسيت في شكل محايد مخزن وقم بمعالجتها طوال الليل باستخدام تقنية معالجة البارافين الآلية القياسية لمدة 12 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بتضمين الأنسجة المعالجة في البارافين بحيث يكون الجانب المراد قطعه متجها أولا لأسفل. الآن ، قم بتقطيع كتل البارافين إلى خمسة أقسام ميكرون. ثم قم بتركيب الأقسام من كل منطقة مصبوغة على الشرائح.

من أجل تحديد موقع منطقة DY ، تحقق بانتظام من الشرائح تحت المجهر. ستكون المناطق المجاورة مباشرة لكل بقعة مصبوغة من الصلبة هي تلك التي كانت على مقربة من القطب المقابل من المصفوفة. أخيرا ، قم بتلطيخ الأقسام حسب الرغبة.

نطاق ديناميكي عالي. يتم عرض صور الماكرو لعين القطط المنزوعة مع مصفوفة أقطاب كهربائية فوق النواة في الموقع بعد التثبيت باستخدام مثبت ديفيدسون وقبل إزالة المصفوفة. تتيح الصلبة الشفافة تصور الأقطاب الكهربائية الفردية في المصفوفة.

كما هو موضح في رأس السهم ، يتم تمييز الأقطاب الكهربائية بنظام ألوان صبغة محدد مسبقا. تستخدم علامات الصبغة هذه الموضوعة مع تباعد منتظم من المعالم التشريحية للحفاظ على الاتساق عبر التجارب. عند إزالة مصفوفة القطب الكهربائي ، يتم تشريح العين يدويا إلى شرائح عينة.

تشير رؤوس الأسهم إلى موقعين من المواقع المجاورة للقطب الكهربائي على الصلبة. يشير الخط المتقطع إلى مستوى التقسيم في هذا القسم التمثيلي الذي تم الحصول عليه من قطع العينة من الشكل السابق ، وتم الحفاظ على الشكل الإجمالي لشريط العينة مع الحد الأدنى من القطع الأثرية النسيجية التفاضلية. لا تزال علامتا الصبغة مرئيتين على الصلبة كما هو موضح في رؤوس الأسهم.

على الرغم من أن الصبغة الخضراء كانت أكثر مرونة من اللون الأحمر ، إلا أن موقع الصبغة يشير إلى موضع القطب. لذلك ، يمكن تقييم أنسجة الشبكية المجاورة للضرر ، إن وجد ، الناجم عن التحفيز الكهربائي كما هو موضح في هذا التكبير ، ولم يتم فصل طبقات الشبكية المجاورة للصبغة الخضراء التي شوهدت في الصورة السابقة من الناحية الواقعية ، وتم الحفاظ على مورفولوجيا الشبكية هنا. يظهر في هذه الصورة الأولى التلوين الخاص التمثيلي والكيمياء المناعية لأقسام أنسجة الشبكية التي تمت معالجتها وفقا للبروتوكول الحالي.

قام الهيماتين بتلطيخ نوى الخلية باللون الأزرق بينما قام eoin بتلطيخ سيتوبلازم الخلية والكولاجين والأنسجة الداعمة ، وظلال مختلفة من اللون الوردي في هذه الصورة ، قام اللون الأزرق السريع الفاخر بتلطيخ المايلين الأزرق. تم استخدام بقعة عداد البنفسج الكريستال لتحديد الخلايا العقدية عن طريق تلطيخ أجسام الصواريخ داخل اللون الأزرق المحيط وتسليط الضوء على خلايا الأقمار الصناعية المحيطة. في هذا القسم المعالج باللون الأزرق الثلاثي ، قام محلول اندماج الحمض القرمزي BRIC بتلطيخ ألياف العضلات باللون الأحمر بينما قام اللون الأزرق بتلطيخ الكولاجين.

في هذه الحالة ، تظهر الصلبة الزرقاء لهذا القسم الملطخة بالحمض الدوري مكونات البروتين السكري للغشاء القاعدي ومكونات النسيج الضام باللون الأرجواني بينما تظهر نوى الخلايا المضادة للبقع باللون الأزرق. تمت معالجة القسم الصلبي الفرعي الموضح في هذه الصورة باللون الأزرق البروسي اللؤلؤي في موقع النزيف. أدى تكوين الهيموسيديرين من خلايا الدم الحمراء المتدهورة وإطلاق مجمعات الحديد إلى إنتاج لون أرجواني.

إضافة اللون الأحمر المحايد تلطخ الجسيمات الحالة باللون الأحمر في هذه الصورة ، تم تلطيخ تركيبات مكافحة الجلوتامين. يمتد هذا الإنزيم المهين للناقل العصبي الموجود في خلايا مولر باللون الأخضر في كلا الاتجاهين مع أجسام خلايا مولر داخل الطبقة النووية الداخلية وتغذية نهاية خلية مولر التي تشكل الغشاء المحدد الداخلي لتلوين بروتين الخيوط العصبية. تم تصنيف هذا البروتين الهيكلي الخلوي ذو السلسلة الثقيلة باللون الأخضر الموجود في سوما الخلية ويعالج بروتين الخيوط العصبية المتقاطعة مع الخيوط العصبية الأخرى للحفاظ على بنية الخلايا العصبية.

يمكن ملاحظة الخلايا العقدية وأكوانها في طبقات الخلايا العقدية والألياف العصبية بينما تظهر محاور الخلايا الأفقية الموجودة على الحدود الخارجية للطبقة النووية الداخلية في شبكية العين القطط باللون الأخضر. في هذه الصورة النهائية ، يظهر البروتين الحمضي الليفي الدبقي هذا البروتين الهيكلي الخلوي باللون الأحمر ، ويتكاثر في خلايا مولر والخلايا النجمية أثناء الدبقي ويمكن رؤيته وهو يبطن طبقة الألياف العصبية مع خلايا مولر التي تشكل امتدادات رقيقة من خلال طبقات الشبكية الداخلية إلى الخارجية. يسمح التلوين المضاد باستخدام DPI باللون الأزرق بتصور طبقات الشبكية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تصور نموذج سير عمل في ثلاثة أبعاد وأن تفكر بانتظام في اتجاه العينات طوال الإجراء. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام جميع الطرق النسيجية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية متعلقة بالسلامة بعد تطويرها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في تطوير العين الإلكترونية لتقييم مستويات التحفيز الآمن على المدى الطويل للمرضى المكفوفين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم سلامة زراعة العين الإلكترونية.