ليزر التقاط ميكروديسيكشن من ميشوورك ترابيكولار نقية جداً من عيون الماوس لتحليل التعبير الجيني

الهدف العام من إجراء التشريح المجهري بالليزر هذا هو تطوير طريقة قوية وقابلة للتكرار لعزل شبكة تربيقية عالية الإثراء عن عيون الفأر باستخدام الفحص المجهري لالتقاط الليزر لعزل الحمض النووي الريبي اللاحق وتحليل التعبير النهائي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طب العيون مثل الجينات المهمة ومسارات الإشارات التي ، عند سوء تنظيمها ، يمكن أن تؤدي إلى أمراض العين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الشبكة التربيقية لعيون الفأر يمكن عزله بشكل متكرر لتحليل التعبير الجيني.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التشريح الدقيق بالليزر هو تقنية قوية تتضمن خطوات مختلفة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله. ابدأ هذا الإجراء بجمع الأنسجة الأمثل للتشريح المجهري بالليزر كما هو موضح في بروتوكول النص. رش محلول إزالة التلوث RNase على الفرشاة والملقط وأوعية التوصيل وظرف التركيب.

بعد المسح جيدا ، اشطف الجهاز بالماء الخالي من النوكلياز وجففه. امسح ناظم الناظم باستخدام 100٪ إيثانول لتجنب التلوث المتبادل. اضغط على كمية صغيرة من O.C.T.على ظرف التثبيت ، ثم قم بإزالة كتلة الأنسجة من القالب وضع الكتلة بعناية على ظرف التثبيت.

بمجرد تجميد كتلة الأنسجة الموجودة على ظرف التثبيت صلبة ، أدخلها في حامل عينة الناظم البريدي. بعد ذلك ، اضبط ناظم البرد لقطع أقسام ثمانية ميكرون وقم بتقطيعها بعناية من خلال كتلة OCT للوصول إلى عينة الأنسجة. بمجرد ملاحظة الأنسجة ، توقف عن التقسيم.

قم بقص الكتل المجمدة من جميع الجوانب باستخدام شفرة حلاقة نظيفة واترك ثلاثة إلى أربعة ملليمترات من OCT تحيط بالأنسجة لتمكين التعامل معها بفرشاة الطلاء. قسم من خلال العين ، والعمل بسرعة. قم بتلطيخ كل قسم ثالث عن طريق إغراق الشريحة بصبغة H&E سريعة من خطوة واحدة لمدة 60 ثانية.

اشطف القسم بماء الصنبور وجففه في الهواء. بعد مسح القسم بعامل مقاصة ، قم بتركيب القسم على شريحة زجاجية مشحونة مع زلة غطاء ، وراجعها تحت المجهر. استمر في التقسيم حتى يصبح TM واضحا في الأقسام الملطخة.

بمجرد أن يبدأ TM في الظهور ، قم بقص قسمين وقم بتثبيتهما على شريحة زجاجية مشحونة لتلوين H & E الروتيني لتشكيل خريطة للقطع باستخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر. بعد أول شريحة لخريطة H & E ، قم بقص واصطفاف ستة أقسام تسلسلية بسمك ثمانية ميكرون في ناظم البرد وقم بتثبيتها في نفس الوقت على شريحة غشاء PET. التمسك بالأنسجة عن طريق تحريك إبهام القفاز لفترة وجيزة على طول الجزء الخلفي من الغشاء.

بعد التركيب ، ضع شريحة غشاء PET على الفور في صندوق منزلق على الثلج الجاف. استمر في تقسيم العين. بعد كل شريحتين لغشاء PET مع ستة أقسام لكل منهما ، اجمع قسمين على شريحة زجاجية مشحونة لإنشاء شريحة خريطة أخرى لتلوين H & E.

استمر في تقسيم ما يقرب من 100 قسم تسلسلي بسمك ثمانية ميكرون حتى يختفي TM مرئيا. تأكد من عدم وجود TM عن طريق تلطيخ قسم واحد بسرعة على شريحة زجاجية مشحونة. بعد إجراء تلطيخ شريحة خريطة H&E كما هو موضح في بروتوكول النص ، راجع شرائح H&E بصريا باستخدام المجهر.

حدد شرائح الخريطة مع TM مرئية بوضوح ويمكن الوصول إليها للقطع. استخدم شرائح غشاء PET بين شرائح الخريطة هذه ل LCM قم بإزالة الصندوق المنزلق الذي يحتوي على أقسام مناديل مجمدة من الفريزر الذي تبلغ درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر وضعه على الثلج الجاف.

قم بمعالجة الشرائح واحدة تلو الأخرى. قم بإصلاح الأقسام عن طريق وضع الشريحة على الفور في مثبطات RNase الباردة بنسبة 75٪ التي تحتوي على RNase لمدة 30 ثانية. اغمس الشريحة برفق في ماء خال من النوكلياز لمدة 10 إلى 15 ثانية لإذابة OCT دون التدخل في أقسام الأنسجة.

قم بتعبئة 300 ميكرولتر من محلول أسيتات كريسيل البنفسجي 1.5٪ بعناية مباشرة على الأقسام واحتضانها لمدة 45 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأقسام مرة واحدة عن طريق وضعها في حمام الإيثانول بنسبة 75٪ لمدة 30 ثانية. ماصة 200 ميكرولتر من محلول Eosin Y على الأقسام وتحتضن لمدة ثلاث إلى خمس ثوان.

قم بتجفيف الأنسجة عن طريق وضع الشرائح لاحقا في 75٪ من الإيثانول ، و 95٪ من الإيثانول ، وأخيرا حمام الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية لكل منهما. امسح نهاية الشريحة بمنديل منديل بين كل خطوة لإزالة السوائل الزائدة. دع الشريحة تجف تماما تحت غطاء المحرك لمدة خمس دقائق.

بمجرد أن يجف ، قم بإجراء المضاعف المشترك الأصغر بعد ذلك مباشرة. تجنب استخدام الزيلين في خطوة المقاصة الأخيرة. سيؤدي علاج الزيلين إلى عدم تركيب قسم الأنسجة بشكل كاف على شريحة الغشاء.

سيقلل الزيلين أيضا من كفاءة التقاط الأنسجة بواسطة LCM. ضع شريحة غشاء PET بحيث يكون جانب الأنسجة الملطخة متجها لأسفل مباشرة على الجزء العلوي من شريحة زجاجية جديدة تم تحميلها على مرحلة المجهر. تأكد من إقران الغشاء والشريحة الزجاجية بإحكام على مرحلة المجهر.

ابدأ المضاعف المشترك الأصغر عن طريق تعيين حدود الشريحة أولا. اختر أقل تكبير 4X في لوحة Objective، ثم حدد منطقة عمل شريحة الغشاء عن طريق تحريك مرحلة XY للمجهر حتى تكون الزاوية اليسرى العليا، حيث يلتقي المعدن والغشاء، مرئية في موجز الفيديو المباشر. في هذه المرحلة ، اضغط على زر الحد 1 وسيظهر مستطيل أحمر على خريطة الطريق.

بعد ذلك ، انقل مرحلة XY إلى الزاوية المقابلة واضغط على زر الحد 2. اضغط على زر المسح الضوئي لإنشاء صورة خريطة طريق للغشاء والأنسجة بين الحدود المحددة. انقر نقرا مزدوجا بالقرب من TM لأحد أقسام العين داخل خريطة الطريق.

يمكن أن يقع TM بالقرب من قمة زاوية القزحية القزحية. بمجرد تحديد TM ، قم بزيادة التكبير إلى 10X وركز يدويا على TM. كرر مع أهداف 20X و 40X. عندما يكون TM في بؤرة التركيز مع هدف 40X ، انتقل إلى منطقة فارغة ، وحدد أداة الرسم اليدوي ، وارسم خطا طويلا على منطقة فارغة من الأنسجة.

اضبط معلمات الليزر بحيث تكون سرعة القطع 34٪ التركيز 58٪ والطاقة 70٪ ثم اضغط على زر القص. قم بإجراء تعديلات دقيقة بالليزر على معلمات السرعة والتركيز والطاقة حتى يتم ملاحظة خط قطع واضح ودقيق. للقطع الدقيق ، تأكد من أن إجراء القطع يتبع الخط المرسوم.

بعد ذلك ، قم بتحميل غطاء أنبوب العزل في حامل الغطاء وافتح الأنبوب. قم بتوصيل حامل الغطاء برفع الغطاء ، وتأكد من عكس الأنبوب. تأكد أيضا من أن مادة الغطاء اللاصق تبرز خارج طرف الغطاء لضمان التقاط الأنسجة المطلوبة بشكل صحيح.

من الأهمية بمكان التأكد بصريا من التقاط الشبكة التربيقية وتثبيتها بغطاء العزل. حدد وضع التشريح اليدوي في لوحة البرامج. راجع بعناية أن TM يقع مباشرة أسفل أنبوب العزل.

اضبط توازن اللون الأبيض واضبط السطوع للحصول على جودة الصورة المثلى. لبدء القص ، اضبط التركيز يدويا وارسم خطا باستخدام الأداة اليدوية. تأكد من أن غطاء التجميع يظل في الوضع العلوي ، ولم يلمس الغشاء بعد.

ارسم دوائر جزئية بالقرب من المكان الذي يلتقي فيه TM بالصلبة واضغط على Cut. بمجرد الانتهاء من التخفيضات الأولى ، ضع الغطاء في الموضع السفلي وأعد ضبط التركيز ، ثم ارسم خطين في المساحة المفتوحة أو الحرة لتوصيل الدائرتين الجزئيتين ، واستكمال الدائرة حول TM. ثم اضغط على قص وجمع الأنسجة من القسم. تأكد من التقاط TM بواسطة غطاء التشريح المجهري.

ضع الغطاء مرة أخرى في الوضع العلوي وكرر العملية على الأقسام المتبقية. اضبط موضع الغطاء قليلا بحيث تتناسب جميع العينات المعزولة مع الغطاء ولا تتداخل. بالنسبة لغشاء PET التالي ، أدخل أنبوب عزل جديد وكرر هذا القسم.

لإجراء تحلل أنسجة TM التشريح الدقيق ، قم بعمل ماصة بعناية 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحلل على غطاء أنبوب التجميع ، مما يضمن أن المخزن المؤقت للتحلل يغطي TM التشريح الدقيق بالكامل. أغلق الغطاء اللاصق برفق واحتضن أنبوب التجميع رأسا على عقب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بجهاز الطرد المركزي على حرارة 800 جم لمدة دقيقتين وضع المحللة على الثلج الجاف. قم بتخزين المحللات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لتنقيتها وتحليلها لاحقا.

يمكن أن يؤثر الحمض النووي الريبي سريع التحلل على تحليل الحمض النووي الريبي النهائي. يجب قياس جودة الحمض النووي الريبي وقياسها كميا باستخدام منصة قائمة على الموائع الدقيقة. تظهر هنا النتائج التمثيلية لتحليل التعبير الجيني للحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة المنقى من الشبكة التربيقية.

يظهر الجل الرقمي للحمض النووي الريبي الكلي المتبقي من أنسجة العين بعد التشريح الدقيق بالليزر رقم سلامة الحمض النووي الريبي المرتفع ، وهو أمر ضروري لتحليل الحمض النووي الريبي اللاحق. بمجرد استخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الأنسجة ، يمكن إجراء تحليل المجرى مثل المصفوفة الدقيقة و RNA-Seq و qPCR. هنا ، تم استخدام تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي الكمي لتحليل التعبير عن الجينات المرتبطة بالشبكات التربيقية ، الميوسيلين و ACTA2 من الحمض النووي الريبي الذي تم جمعه بواسطة LCM.

يتضح من الخريطة الحرارية التي تم إنشاؤها من البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل المصفوفة الدقيقة أنه يمكن استخدام هذه التقنية لفهم تغيرات التعبير الجيني في الشبكة التربيقية للفئران البرية والفئران بالضربة القاضية ذات النمط الظاهري المرتفع IOP. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من يوم واحد لكل بيولوجي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا ضروريا حيث يصعب تعلم خطوات التشريح المجهري بالليزر بسبب صعوبة تصور الخلايا ذات الأهمية وغياب معايير لهذه العينات الفريدة.

الاعتماد على المشغل الماهر أمر بالغ الأهمية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحمض النووي الريبي في كميات صغيرة من الأنسجة يمكن أن يتحلل بسرعة. يجب اتخاذ الاحتياطات مثل تطهير المعدات من RNase ، وتقليل التعرض للهواء ، والحفاظ على برودة الأنسجة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتأثيرات زيادة ضغط العين على التعبير الجيني الخاص بالشبكة التربيقية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل تقييم التغيرات في التعبير الجيني في شبكية العين الناتجة عن زيادة ضغط العين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل RNA-Seq أو المصفوفة الدقيقة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل مسارات الإشارات التي يتم تغييرها في الشبكة التربيقية للفئران ذات الضغط المرتفع داخل العين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة تغييرات التعبير الجيني بشكل أكثر فعالية في الشبكة التربيقية في نماذج الفئران.