طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي
April 9th, 2013
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم. العدلات التي تمتلك وظائف ينظم transcriptionally مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. يمكن دراسة هذه الوظائف مع أسلوب المعروضة هنا، والذي يسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى التدفق الخلوي معزولة
تستخدم هذه التجربة قياس التدفق الخلوي لاكتشاف وقياس البروتينات النووية في النوى المعزولة وذات العلامات المناعية من العدلات لتنقية العدلات من الدم المحيطي البشري. قم بإزالة خلايا الدم الحمراء باستخدام الدكسترين متبوعا بالطرد المركزي المتدرج للبلازما. ثم باستخدام الأجسام المضادة للمستقبلات ، تحفز العدلات المنقاة عبر الإنتجرينات أو مستقبلات FC.
تابع عزل النوى وإصلاح العينات لوضع العلامات المناعية بأجسام مضادة محددة ضد العامل النووي المعني ب NU. على سبيل المثال ، يقوم NF kappa B أخيرا بتحليل النوى عن طريق قياس التدفق الخلوي من أجل اكتشاف التغييرات الصغيرة في تنشيط العامل النووي. تم الحصول على النتائج التي تظهر أن تحفيز العدلات عبر الإنتجرينات يؤدي إلى زيادة التركيز النووي لعامل النسخ N من كابا ب عادة ما تتم دراسة مسارات الإشارات التي تؤدي إلى تنشيط العامل النووي بواسطة فحوصات الجينات المراسلة أو عن طريق فحوصات تحول الحركة الكهربية في الخلايا الأولية.
غالبا ما تكون هذه الأساليب غير مناسبة. يوفر قياس التدفق الخلوي اكتشافا سريعا وتقديرا كميا للبروتينات النووية في النوى المعزولة. ابدأ ب 10 ملليلتر من الدم الذي تم جمعه حديثا من المتطوعين البالغين الأصحاء.
ماصة ملليلترين من محلول دكسترين T 500 6٪ في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلترا. ثم أضف 10 ملليلتر من الدم الممزوج بقلب الأنبوب مرتين أو ثلاث مرات واترك 45 دقيقة لترسيب كريات الدم الحمراء بالجاذبية في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا. ضع خمسة ملليلتر من عبوة FI fial.
احصد البلازما الغنية بالكريات البيض التي تشكلت فوق كريات الدم الحمراء المترسبة. ضعيها بعناية فوق عبوة المويال لتشكيل مرحلتين ، جهاز طرد مركزي عند 516 جي ثانية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وكسر حبيبات الخلية عن طريق النقر على الأنبوب على الرف.
ثم أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من PBS البارد. انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 290 جيجابايت لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. كسر حبيبات الخلية كما كان من قبل وأضف 10 مل من محلول منخفض التوتر البارد إلى كريات الدم الحمراء الغسول.
امزج عن طريق تحريك الأنبوب برفق لمدة دقيقة واحدة بالضبط. بعد ذلك ، أضف 10 مل من مزيج محلول مفرط التوتر البارد واحفظه على الثلج. الآن تعداد الخلايا بعد تكوير العدلات عن طريق الطرد المركزي.
نعلق PMN عند 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر. في PBS البارد ، حافظ على الخلايا على الجليد. Aliquot 100 ميكرولتر من تعليق PMN في أنابيب einor سعة 1.5 ملليلتر.
ثم أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة المقابل بمعدل 10 ميكروغرام لكل مليلتر واحتضنه على الثلج لمدة 15 دقيقة. لغسل الخلايا ، أضف ملليلترا واحدا من جهاز الطرد المركزي PBS البارد وشفط المادة الطافية. ثم اكسر حبيبات الخلية برفق واغسلها مرتين أخريين باستخدام PBS.
لإزالة الجسم المضاد غير المرتبط ، أعد تعليق PMN المغسول في نفس الحجم الأولي من PBS الدافئ الذي يحتوي على 60 ميكروغراما لكل مليلتر من احتضان IgG المضاد للذهاب عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى 20 دقيقة اعتمادا على العامل النووي ذي الاهتمام. أضف الآن ملليلترا واحدا من PBS البارد بعد تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، قم بإزالة snat وتجميد كريات الخلية على الفور في حمام الإيثانول الثلجي الجاف. لكل عينة ، قم بإزالة الأنبوب من مجموعة الثلج الجاف ، ومسح حمام الإيثانول ، ونظفه وإعادة التأهيل.
قم بتعليق كريات PMN المجمدة في 100 ميكرولتر من محلول منخفض التوتر البارد. ضع جميع العينات على الجليد لمراقبة العينات للتأكد من سلامة النوى. وصمة عار Eloqua من تعليق النوى باللون الأزرق الثلاثي.
إذا كان تعليق النوى يحتوي على العديد من الخلايا السليمة أو الحطام ، فمن الأفضل التخلص من المستحضر وبدء الإجراء بعينة أخرى. بعد تكوير النوى عن طريق الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية فائقة ثم لإصلاح النوى عند 100 ميكرولتر من محلول الألدهيد البارد 4٪ واحتضان النوى على الجليد. بعد تكوير النوى ، قم بإزالة snat بعناية عند 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية الباردة واحتضان العينات على الجليد لمدة 10 دقائق.
ثم حصاد نوى البيرم عن طريق الطرد المركزي. في هذه المرحلة ، لا تعلق الكريات النوى جيدا في الجزء السفلي من الأنبوب. يوصى ب centrif future مرة أخرى.
إذا انفصلت الحبيبات لمنع مواقع الارتباط غير المحددة ، فإننا نعلق النوى في 500 ميكرولتر من البرد ، و 4٪ مصل بقري الجنين في PBS ونحتضن على الجليد لمدة 20 دقيقة. قم بتحبيير النوى عن طريق الطرد المركزي ، ثم أعد تعليق النوى و 100 ميكرولتر من PBS البارد الذي يحتوي على 4٪ FBS و 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة ضد العامل النووي المهم. احتضان العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة بعد غسل العينات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS البارد مع 4٪ FBS ، نقوم بتعليق النوى في 100 ميكرولتر من PBS البارد الذي يحتوي على 4٪ FBS و 10 ميكروغرام مليلتر من الأجسام المضادة الثانوية المسماة FZ المقابلة تحتضن على الجليد لمدة 20 دقيقة بعد غسلتين ، وإعادة تعليق النوى في 400 ميكرولتر من البارد 4٪ بارالديهايد في PBS.
قم بتحليل النوى المناعية في مقياس التدفق الخلوي مثل فحص الحقائق أو جهاز مشابه. اضبط إعدادات الاستحواذ اثنين من FSC بمقياس لوغاريتمي عند 10 إلى سالب SSC بمقياس لوغاريتمي عند 196 ونواة البوابة في مخطط التبني. الحصول على 10،000 نواة لكل عينة.
ثم قم بتحليل مضان نوى البقع الملائمة من خلال قناة FL الواحدة التي تم تعيينها على مقياس لوغاريتمي عند 400. عادة ما توفر طريقة تنقية PMN هذه العدلات غير المحفزة بنقاوة أكبر من 95٪ من نوى PMN معزولة بإنتاجية عالية ، معزولة إلى النوى ، ويمكن التعرف عليها بسهولة كمجموعة مختلفة عن PMN السليمة في مقياس التدفق الخلوي مع مخطط نقطي عند التحفيز. من خلال الربط المتقاطع بين بيتا ، يتم ترجمة تكامل NF kappa B إلى النواة ويتم الكشف عن هذه الزيادة في NF kappa B النووي على أنها زيادة في التألق.
وبالمثل ، فإن تحفيز PMN عن طريق ربط بيتا اثنين من الإنتجرينات يؤدي أيضا إلى تنشيط NF kappa B كما يتضح من زيادة التألق. تسمح حساسية هذه الطريقة بالكشف عن التغيرات الصغيرة في مستويات العامل النووي كما يتضح من حقيقة أن إنتجرينات بيتا ون ، التي تربط بروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل الفيبرونيكتين تحفز تنشيط NF kappa B أقوى من بيتا اثنين من الإنتجرينات ، التي ترتبط بجزيئات الالتصاق على الخلايا الأخرى. توفر هذه الطريقة مرونة كبيرة لأنه يمكن استخدام العديد من الفلوروكرومات المختلفة ولأنها تسمح بإعداد النوى من أنواع مختلفة من الخلايا ، استخدمت هذا النهج البسيط والاقتصادي لدراسات نقل الإشارات التي تنطوي على تغيرات في مستويات البروتين في نواة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لاكتشاف وتحديد كمية البروتينات النووية في الخلايا العدلية باستخدام قياس التدفق الخلوي. يسمح هذا النهج للباحثين بتحليل تنشيط عوامل النسخ، مثل NF kappa B، في النويات المعزولة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- قياس التدفق الخلوي
الخلفية
- الخلايا العدلية هي أكثر أنواع الكريات البيض وفرة في الدم.
- تلعب دورًا حيويًا في الاستجابة المناعية من خلال إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات.
- فهم وظائفها النووية ضروري للحصول على رؤى حول التنظيم المناعي.
- قياس التدفق الخلوي هو أداة قوية لتحليل المكونات الخلوية.
هدف الدراسة
- لتنقية الخلايا العدلية من الدم المحيطي البشري.
- لدراسة تنشيط العوامل النووية استجابةً للتحفيز.
- لتوفير منهجية مفصلة لتحديد كمية مستويات البروتينات النووية.
الطرق المستخدمة
- عزلة الخلايا العدلية من الدم البشري باستخدام الدكسترين وطريقة الترسيب بالتدرج الكثافة.
- تحفيز الخلايا العدلية بالأجسام المضادة المضادة للمستقبلات التي تستهدف الإنتغرينات أو مستقبلات FC.
- عزلة النويات وتثبيتها للتصنيف المناعي باستخدام الأجسام المضادة المحددة.
- تحليل النويات بواسطة قياس التدفق الخلوي لاكتشاف التغيرات في تنشيط العوامل النووية.
النتائج الرئيسية
- تحفيز الخلايا العدلية عبر الإنتغرينات يؤدي إلى زيادة التركيز النووي لـ NF kappa B.
- يكشف قياس التدفق الخلوي بشكل فعال عن التغيرات الصغيرة في تنشيط العوامل النووية.
- تساهم النتائج في فهم مسارات الإشارات في الخلايا العدلية.
- يمكن تطبيق المنهجية لدراسة عوامل نووية مختلفة في الخلايا الأولية.
الاستنتاجات
- توفر هذه المنهجية طريقة موثوقة لدراسة تنشيط العوامل النووية في الخلايا العدلية.
- يعتبر قياس التدفق الخلوي تقنية قيمة لتحليل وظائف الخلايا المناعية.
- يمكن للأبحاث الإضافية استكشاف مسارات الإشارات الإضافية وآثارها.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Detecting nuclear factor activation in primary human neutrophils enables mechanistic de-risking of inflammatory signaling pathways in drug discovery. This flow cytometry-based method provides quantitative, reproducible readouts of transcription factor dynamics, supporting target validation and assay development in immunology-focused programs. By overcoming transfection limitations in short-lived primary cells, it offers a scalable solution for early-stage biomarker alignment and predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB and Elk-1 activation in primary human neutrophils to clarify proinflammatory signaling mechanisms.
- Operational Value: Provides a transfection-independent method for studying transcriptionally regulated responses in difficult-to-transduce primary immune cells.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking receptor stimulation (e.g., integrins, Fc receptors) to nuclear translocation of key inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates isolated, immunolabeled neutrophil nuclei suitable for high-throughput flow cytometric screening of modulators of nuclear factor activation.
- Quantitative Output: Enables detection of small changes in nuclear protein concentration, facilitating dose-response and IC50 determination in compound screening.
- Reproducibility: Standardized neutrophil isolation and nuclear preparation workflows yield consistent fluorescence readouts across replicates and donors.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying neutrophil-driven inflammatory pathways in models of infection, autoimmunity, and tissue injury.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism elucidation with preclinical validation by providing a primary human cell-based readout of target engagement.
- Mechanistic De-risking: Reduces reliance on surrogate systems by enabling direct measurement of transcription factor activation in the therapeutically relevant cell type.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in immunology and enabling progression from target engagement assays to functional validation in primary human neutrophils before lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by quantifying nuclear translocation of transcription factors downstream of receptor stimulation (e.g., β1/β2 integrins, Fc receptors).
- Screening: Delivers assay-ready nuclei with quantitative fluorescence outputs suitable for screening compound libraries for modulators of NF-κB or Elk-1 activation.
- Analytics: Provides single-nucleus resolution and fluorescence intensity measurements enabling statistical comparison of stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Uses primary human neutrophils to enhance clinical relevance of mechanistic findings, supporting biomarker alignment in inflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple nuclear factors and fluorophores, allowing reuse across projects targeting different signaling pathways in neutrophils or other primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing direct, quantitative evidence of nuclear factor activation in primary human immune cells.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for neutrophil isolation, nuclear preparation, and flow cytometric analysis with minimal specialized equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early-stage immunomodulator programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on target pathway modulation in a disease-relevant primary cell system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human blood processing, neutrophil isolation, and flow cytometry compensation and gating.
- Dependent on access to flow cytometers capable of fluorescence detection in the appropriate channels (e.g., FL1 for FITC-labeled antibodies).
- Necessitates standardization of stimulation conditions, antibody titers, and nuclear fixation/permeabilization protocols across users and sites.
- Adaptation to other cell types requires optimization of hypotonic/hypertonic lysis conditions and validation of nuclear integrity.
- Practical limitations include neutrophil donor variability and the short ex vivo lifespan of primary neutrophils, necessitating same-day experimentation.
