طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

تستخدم هذه التجربة قياس التدفق الخلوي للكشف عن البروتينات النووية وتقديرها كمياً في النوى المعزولة والموسومة مناعياً من الخلايا المتعادلة لتنقية الخلايا المتعادلة من الدم الطرفي البشري. يتم إزالة خلايا الدم الحمراء باستخدام الديكسترين، يليه إجراء طرد مركزي متدرج الكثافة للبلازما. بعد ذلك، وباستخدام أجسام مضادة لمستقبلات محددة، يتم تحفيز الخلايا المتعادلة المنقاة عبر الإنتغرينات أو مستقبلات FC.

باشر بعزل النوى وتثبيت العينات للوسم المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة ضد العامل النووي NU المراد دراسته، على سبيل المثال NF kappa B، ثم قم بتحليل النوى بواسطة قياس التدفق الخلوي للكشف عن التغيرات الطفيفة في تنشيط العامل النووي. يتم الحصول على نتائج تظهر أن تحفيز الخلايا المتعادلة عبر الإنتغرينات الخاصة بها يؤدي إلى زيادة التركيز النووي لعامل النسخ N of kappa B. وعادة ما تُدرس مسارات التأشير التي تؤدي إلى تنشيط العامل النووي من خلال مقاييس الجينات المراسلة أو مقاييس تغيير الحركية الكهربائية في الخلايا الأولية.

غالبًا ما تكون هذه الطرق غير مناسبة. يوفر قياس التدفق الخلوي الكشف السريع والتقدير الكمي للبروتينات النووية في النوى المعزولة. ابدأ بـ 10 milliliters من الدم الذي تم جمعه حديثًا من متطوعين بالغين أصحاء.

انقل باستخدام الماصة 2 mL من محلول dextrin T 500 بتركيز 6% إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 mL. ثم أضف 10 mL من الدم وامزجهما عن طريق قلب الأنبوب مرتين أو ثلاث مرات، واترك العينة لمدة 45 دقيقة لترسيب الكريات الحمراء بفعل الجاذبية في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 15 mL. ضع 5 mL في FI fial pack.

قم بجمع البلازما الغنية بالكريات البيضاء التي تكونت فوق الكريات الحمراء المترسبة. ضعها بعناية في طبقة فوق حزمة الفيال لتكوين طورين، ثم قم بالطرد المركزي عند 516 Gs لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. تخلص من السائل الطافي وقم بتفكيك كتلة الخلايا عن طريق النقر بالأنبوب على الحامل.

ثم أعد تعليق الخلايا في 10 milliliters من PBS البارد. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 milliliter وقم بإجراء الطرد المركزي عند 290 Gs لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. قم بتفتيت كتلة الخلايا المترسبة كما سبق وأضف 10 milliliters من محلول ناقص التوتر البارد لتحليل كريات الدم الحمراء.

امزج المكونات عن طريق تدوير الأنبوب بلطف لمدة دقيقة واحدة بالضبط. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من مزيج المحلول عالي التوتر البارد واحفظه على الثلج. الآن قم بتعداد الخلايا بعد تجميع الخلايا المتعادلة عن طريق الطرد المركزي.

نقوم بتعليق الخلايا متعددة الأشكال النووية (PMN) بتركيز 10⁷ خلية/مللتر. تُحفظ الخلايا في محلول PBS البارد على الثلج. يتم توزيع 100 µL من معلق PMN في أنابيب إبندورف سعة 1.5 مللتر.

بعد ذلك، أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة المقابل بتركيز 10 micrograms per milliliter واتركه في الحاضنة على الثلج لمدة 15 minutes. لغسل الخلايا، أضف one milliliter من PBS البارد ثم قم بالطرد المركزي واسحب السائل الطافي. بعد ذلك، قم بتفكيك كتلة الخلايا بلطف واغسلها مرتين إضافيتين باستخدام PBS.

لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة، أعد تعليق الخلايا متعددة الأشكال من النخاع (PMN) المغسولة في نفس الحجم الأولي من محلول PBS الدافئ الذي يحتوي على 60 micrograms per milliliter من go anti muse IgG، ثم حضنها عند 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من دقيقة واحدة إلى 20 دقيقة اعتماداً على العامل النووي محل الدراسة. الآن أضف 1 milliliter من محلول PBS البارد. بعد تجميع الخلايا في شكل كريسبي (pelleting) عن طريق الطرد المركزي، قم بإزالة الرائق وتجميد كتل الخلايا فوراً في حمام من الثلج الجاف والإيثانول. وبالنسبة لكل عينة، أخرج الأنبوب من حمام الثلج الجاف والإيثانول، وامسحه جيداً ثم أعد تعليقه.

قم بتعليق كرات PMN المجمدة في 100 µL من محلول ناقص التوترية بارد. ضع جميع العينات على الثلج لمراقبة سلامة النوى في العينات. صبغ كمية من معلق النوى بصبغة tripan blue.

إذا كان معلق النوى يحتوي على العديد من الخلايا السليمة أو الحطام الخلوي، فمن الأفضل التخلص من التحضير وبدء الإجراء بعينة أخرى. بعد تجميع النوى عن طريق الطرد المركزي، قم بإزالة supernatant بحذر شديد، ثم قم بتثبيت النوى باستخدام 100 µL من محلول 4% Paraform aldehyde البارد، واترك النوى في الحضانة على الثلج. بعد تجميع النوى، قم بإزالة supernatant بعناية وأضف 100 µL من محلول permeation buffer البارد، ثم حضن العينات على الثلج لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، يتم حصاد النوى المنفذة عن طريق الطرد المركزي. في هذه المرحلة، لا تلتصق كتل النوى جيداً بقعر الأنبوب، لذا يُوصى بإعادة عملية الطرد المركزي مرة أخرى.

لمنع الارتباط غير النوعي، نقوم بتعليق النوى في 500 µL من مصل بقري جنيني بتركيز 4% بارد في محلول PBS، ثم نحضنها على الثلج لمدة 20 دقيقة. يتم تجميع النوى في راسب عن طريق الطرد المركزي، ثم تُعاد عملية التعليق للنوى في 100 µL من محلول PBS بارد يحتوي على 4% FBS و 2.5 µg/mL من الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد العامل النووي المستهدف. تُحضن العينات على الثلج لمدة 20 دقيقة، وبعد غسل العينات مرتين باستخدام 500 µL من محلول PBS بارد مع 4% FBS، نعلق النوى في 100 µL من محلول PBS بارد يحتوي على 4% FBS و 10 µg/mL من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بـ FZ، ثم تُحضن على الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد غسلتين، تُعاد عملية تعليق النوى في 400 µL من محلول Paraldehyde بتركيز 4% بارد في PBS.

قم بتحليل النوى الموسومة مناعياً باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer) مثل جهاز FactScan أو جهاز مشابه. اضبط إعدادات الاستحواذ بحيث يكون FSC بمقياس لوغاريتمي عند 10⁻¹ و SSC بمقياس لوغاريتمي عند 196، ثم حدد بوابة النوى (gate nuclei) في مخطط النقاط (dot plot). قم باستحواذ 10,000 نواة لكل عينة.

ثم قم بتحليل فلورة النوى المصبوغة بـ fitsy من خلال القناة FL واحدة المحددة بمقياس لوغاريتمي عند 400. توفر طريقة تنقية PMN هذه عادةً خلايا متعادلة غير محفزة بنقاء يزيد عن 95%؛ حيث يتم عزل نوى PMN بإنتاجية عالية، وعند عزلها كنوى، يمكن التعرف عليها بسهولة كجماعة مختلفة عن PMN السليمة في مقياس التدفق الخلوي باستخدام المخطط النقطي عند التحفيز. ومن خلال الربط التشابكي لـ beta one integrins، يتم نقل NF kappa B إلى النواة، ويتم الكشف عن هذه الزيادة في NF kappa B النووي كزيادة في الفلورة.

وبالمثل، فإن تحفيز الخلايا متعددة الأشكال النوكليارية (PMN) عن طريق الربط المتقاطع لبروتينات beta two integrins يؤدي أيضاً إلى تنشيط NF kappa B، كما يتضح من زيادة الفلورة. وتسمح حساسية هذه الطريقة بالكشف عن التغيرات الطفيفة في مستويات العامل النووي، وهو ما يظهر في حقيقة أن beta one integrins، التي ترتبط ببروتينات المصفوفة خارج الخلوية مثل fibronectin، تحفز تنشيط NF kappa B بشكل أقوى من beta two integrins، التي ترتبط بجزيئات الالتصاق الموجودة على الخلايا الأخرى. وتتميز هذه الطريقة بمرونة كبيرة نظراً لإمكانية استخدام العديد من الفلوروكرومات المختلفة، ولأنها تسمح بتحضير النوى من أنواع مختلفة من الخلايا، مما يجعل هذا النهج البسيط والاقتصادي مفيداً في دراسات نقل الإشارة التي تتضمن تغيرات في مستويات البروتين داخل نوى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.