التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار في الموضع التهجين في خميرة الخباز

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن وجود جزيئات mRNA ذات خصوصية جزيء واحد في خلايا الخميرة المفردة. أولا ، قم بإصلاح خلايا الخميرة والفورمالديهايد باستخدام المخزن المؤقت المحتوي على اللياز. نفاذية الخلايا حتى لا يتم سطوع معظم الخلايا.

بعد ذلك ، قم باحتضان خلايا البيرم بجزيئات الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل الموسومة بالفلورسنت ثم قم بتركيب الخلايا على زلة غطاء نظيفة بالبلازما. في النهاية ، يمكن للنتائج التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري الفلوري أن توضح بالتفصيل وجود وتوطين جزيئات الرنا المرسال في الخلايا المفردة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التعبير الجيني والمصفوفات الدقيقة والبقع الشمالية ، هي أنه يمكن تصور الرنا المرسال الفردي في الخلايا المفردة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقل النسخ. يتضمن ذلك تحديد عدد الحمض النووي الريبي للذراع لكل خلية في مجموعة سكانية يمكن أن تبلغ نماذج التنظيم على مستوى المروج. يمكن استخدامه أيضا لتحديد التوطين ونصف عمر النصوص أثناء دورة الخلية.

في البلازما برين غرفة الفراغ غطاء الموقف ينزلق على الشرائح. ثم ضع حجرة التفريغ في الميكروويف وتأكد من إغلاقها. قم بتشغيل المضخة بمجرد بدء تشغيل المضخة.

قم بتشغيل المكنسة الكهربائية الآن ، وقم بتشغيل الميكروويف وتوقف بعد خمس ثوان من ظهور البلازما. ثم قم بإيقاف تشغيل الفراغ ، متبوعا بالمضخة. اسحب غرفة التفريغ.

ثم انقل زلقات الغطاء التي تم تنظيفها إلى 12. تنمو صفائح الآبار الخميرة إلى A 600 من حوالي 0.1 إلى 0.2. في الحد الأدنى من الوسائط ، ينتج 10 ميل من الخلايا ما يكفي لحوالي 10 تهجين.

أضف حجما واحدا من 37٪ فورمالديهايد مباشرة إلى وسط النمو واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. الطرد المركزي للخلايا عند 3000 جي لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت B ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

اغسل مرتين بملليلتر واحد من المخزن المؤقت المثلج البارد B في أنبوب طرد مركزي صغير. جهاز طرد مركزي عند 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من طلاء الكرو ، وقم بتخزينه واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

راقب الخلايا مجهريا كل بضع دقائق حتى تصبح معظم الخلايا سوداء. ثم يغسل مرتين باستخدام عازلة مثلجة. ب- الغزل بسرعة منخفضة تبلغ 3 ، 500 دورة في الدقيقة.

أضف ملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول resus. الحبيبات برفق وضعها طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو قم بتخزينها إلى أجل غير مسمى عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتحضير محلول التهجين ، أضف واحدا إلى ثلاثة ميكرولتر من المسبار إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين.

ثم الدوامة وأجهزة الطرد المركزي. لقد قمنا بتصوير ثلاثة جينات مختلفة في وقت واحد باستخدام ثلاث مجموعات مسبار مختلفة. الآن جهاز الطرد المركزي ، عينة الخميرة الثابتة والشفط من عازلة الغسيل.

أضف محلول التهجين واحتضنه في الظلام مع رج لطيف طوال الليل عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. عالج الشفاه النظيفة ب 150 ميكرولتر من 0.01٪ بوليسين لمدة خمس دقائق. ثم أسبافر وتجف في الهواء.

تغسل الشرائح ثلاث مرات بالماء المقطر وتجف بالهواء بعد غسل واحد باستخدام XSSC Resus واحد ، وتعلق الخلايا في 150 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر. بقع داغة معدة حديثا ، وهي عبارة عن تعليق الخلية على زلات الغطاء المعالج بالبولي ليسين واحتضانها لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإذابة وسط تركيب الذهب المطول إلى درجة حرارة الغرفة.

ضع ثلاثة ميكرولترات على شريحة. ثم أضف حوالي 0.5 مل من الإيثانول إلى زلة الغطاء. في لوحة 12 بئر ، قم بإزالة زلة الغطاء وجففها في الهواء أثناء الإمساك بالملاقط.

ضع جانب خلية الغطاء المنزلق لأسفل على وسط التثبيت واتركه يتماسك لعدة ساعات أو طوال الليل في الظلام. أغلق الحواف بطلاء الأظافر وانتقل إلى التصوير. التقط Zack من الصور حول النقطة المرجعية حيث تبلغ المسافة الإجمالية خمسة ميكرومترات بحجم 0.2 ميكرومتر.

كرر التصوير لكل قناة صبغة تتوافق مع كل مجموعة مسبار. ثم تابع كما هو مفصل في النص المصاحب. لتحديد الخلايا عن طريق تجزئة مستجمعات المياه ، حدد البقع باستخدام تدرج شعاعي وقم بقياس البقع باستخدام نوبة غاوسية.

عادة ، يتم حساب الرسوم البيانية من صور الأسماك واستخدامها لتحديد عدد الرنا المرسال الموجود في الخلايا المفردة. تتمثل إحدى المزايا المهمة لقياس الحمض النووي الريبي القائم على الفحص المجهري في أنه يمكن للمرء الحصول على معلومات حول توطين النصوص. على سبيل المثال ، تستخدم هذه السمكة مجسات مفردة لتحديد mRNAs في خلايا مفردة مع أليل واحد CCB CBF محفز.

نظرا لوجود العديد من جزيئات mRNA في موقع النسخ ، فمن السهل تحديد وجود وموقع مواقع النسخ داخل النواة. يسهل استخدام الأصباغ المختلفة لتسمية mRNAs للجينات المختلفة القياس الكمي لأنواع mRNA المتعددة في نفس الخلايا. في هذه التجربة ، تم احتضان خلايا الخميرة في وجود عامل ألفا والسوربيتول باستخدام الأسماك مع مجسات Stelara ، تظهر البيانات خلية واحدة تستجيب فقط للفرمون المشار إليه بواسطة FUS أحمر موقع بدء واحد.

في الوقت نفسه ، تستجيب خلية أخرى في الغالب للسوربيتول ، حيث يتم تصنيف موقع البداية S TL باللون الأخضر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية جزيئات الرنا المرسال المفردة وتصورها في الخميرة بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية بشكل صحيح في غضون يومين.

تذكر أن يكون لديك تركيز كثيف بما فيه الكفاية من الخلايا. تتطلب العينات المخففة المزيد من الحقول ليتم تصويرها وتخزينها.