التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن وجود جزيئات mRNA بخصوصية الجزيء الواحد في خلايا خميرة فردية. أولاً، يتم تثبيت خلايا الخميرة والفورمالديهايد باستخدام محلول منظم يحتوي على اللييز. ثم يتم نفاذ الخلايا حتى لا تظهر معظم الخلايا ساطعة في تباين الطور.

بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا المنفذة مع جزيئات DNA أحادية السلسلة موسومة بفلورسنت، ثم تُثبت الخلايا على شريحة غطاء تم تنظيفها بالبلازما. وفي النهاية، يمكن لنتائج المجهر الفلورسنتي أن توضح بالتفصيل وجود وتمركز جزيئات mRNA في الخلايا المفردة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التعبير الجيني والمصفوفات الدقيقة وبصمات نورثرن، في إمكانية تصور جزيئات mRNA الفردية داخل الخلايا المفردة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال عملية النسخ. ويشمل ذلك تقدير كمية جزيئات arm RNAs لكل خلية في مجموعة سكانية خلوية، مما قد يساهم في تطوير نماذج التنظيم على مستوى المحفز. كما يمكن استخدامها لتحديد التموضع وأوقات نصف العمر للنصوص الجينية خلال الدورة الخلوية.

في غرفة فراغ تنظيف بالبلازما، ضع شرائح التغطية على الشرائح الزجاجية. ثم ضع غرفة الفراغ في جهاز الميكروويف وتأكد من إحكام إغلاقها. قم بتشغيل المضخة وبمجرد بدء عملها.

قم بتشغيل المفرغة الآن، ثم قم بتشغيل الميكروويف وأوقفه بعد خمس ثوانٍ من ظهور البلازما. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل المفرغة، ثم المضخة. اسحب غرفة التفريغ للخارج.

ثم انقُل شرائح التغطية بحيث يكون الجانب النظيف للأعلى إلى أطباق ذات 12 بئراً، وقم بتنمية الخميرة حتى تصل قيمة A 600 إلى حوالي 0.1 إلى 0.2. في الوسط الغذائي الأدنى، توفر 10 mils من الخلايا كمية كافية لحوالي 10 عمليات تهجين.

أضف حجمًا يعادل 1/10 من الفورمالديهايد بتركيز 37% مباشرة إلى وسط النمو، ثم حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 3000 Gs لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الراسب في 1 mL من المنظم B وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

اغسل المادة مرتين باستخدام 1 mL من المنظم B المبرد بالثلج في أنبوب طرد مركزي دقيق. قم بالطرد المركزي بسرعة 13,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، أضف 1 mL من منظم زرع الكريات (sphero plating buffer) واحضن العينة عند 37 °C لمدة 15 دقيقة.

راقب الخلايا مجهرياً كل بضع دقائق حتى تصبح معظم الخلايا سوداء. ثم اغسلها مرتين باستخدام محلول منظم بارد جداً (بدرجة حرارة الجليد). ب. قم بالطرد المركزي بسرعة منخفضة تبلغ 3,500 RPM.

أضف 1 mL من محلول الإيثانول بتركيز 70%. قم بتعليق الراسب برفق واحفظه طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C أو خزنّه لفترة غير محددة عند درجة حرارة -20 °C. ولتحضير محلول التهجين، أضف من 1 إلى 3 µL من المسبار إلى 100 µL من منظم التهجين.

ثم قم بالرج الدوامي والطرد المركزي. لقد قمنا بتصوير ثلاثة جينات مختلفة في آن واحد باستخدام ثلاث مجموعات مختلفة من المسابير. الآن، قم بطرد عينة الخميرة المثبتة مركزياً، ثم اشفط محلول الغسيل.

أضف محلول التهجين ثم حضّن العينة في الظلام مع الرج اللطيف طوال الليل عند 37 درجة Celsius وفي اليوم التالي. عالج أغطية الشرائح النظيفة بـ 150 µL من polylysine بتركيز 0.01% لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اسحب السائل واتركه ليجف في الهواء.

تُغسل الشرائح ثلاث مرات بالماء المقطر وتُجفف بالهواء بعد غسلة واحدة بـ 1X SSC. يتم تعليق الخلايا في 150 µL من صبغة DAPI المحضرة حديثًا بتركيز 0.1 µg/mL. توضع كمية صغيرة من معلق الخلايا على أغطية شرائح معالجة بالبولي لايسين وتُحضن لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، يتم إذابة وسط تثبيت الذهب (gold mounting medium) المبرد في درجة حرارة الغرفة.

ضع 3 µL على شريحة. ثم أضف حوالي 0.5 mL من الإيثانول إلى غطاء الشريحة. وفي الطبق ذي الـ 12 بئراً، قم بإزالة غطاء الشريحة واتركه يجف في الهواء أثناء إمساكه بالملقط.

ضع غطاء الشريحة بحيث تكون جهة الخلية لأسفل على وسط التثبيت واتركه يتصلب لعدة ساعات أو طوال الليل في الظلام. أغلق الحواف بطلاء الأظافر ثم ابدأ بعملية التصوير. التقط مجموعة (Zack) من الصور حول النقطة المرجعية بحيث تكون المسافة الإجمالية 5 µm وبحجم 0.2 µm.

كرر عملية التصوير لكل قناة صبغية مقابلة لكل مجموعة مسابير. ثم تابع كما هو مفصل في النص المرفق. ولتحديد الخلايا عن طريق تقسيم مستجمع المياه (watershed segmentation)، حدد البقع باستخدام تدرج شعاعي وقم بقياس البقع باستخدام الملاءمة الغاوسية (Gaussian fit).

عادةً ما يتم حساب المخططات البيانية التكرارية (histograms) من صور التهجين الموضعي المتألق (FISH) وتُستخدم لتحديد عدد جزيئات mRNA الموجودة في الخلايا المفردة. وتتمثل الميزة الهامة للتقدير الكمي لـ RNA القائم على المجهر في إمكانية الحصول على معلومات حول تموضع النسخ. على سبيل المثال، تستخدم تقنية FISH هذه مجسات مفردة لتحديد جزيئات mRNA في الخلايا المفردة التي تحتوي على أليل واحد من CCB CBF القابل للتحفيز.

نظرًا لوجود العديد من جزيئات mRNA في موقع النسخ، فمن السهل تحديد وجود ومواقع مواقع النسخ داخل النواة. ويُسهّل استخدام صبغات مختلفة لوسم mRNAs لجينات مختلفة عملية تقدير كمية أنواع متعددة من mRNA في الخلايا نفسها. في هذه التجربة، تم تحضين خلايا الخميرة بوجود alpha factor وsorbitol، وباستخدام Stelara probes، تُظهر البيانات خلية واحدة تستجيب فقط للفيرومون، وهو ما يشير إليه موقع بدء FUS واحد باللون الأحمر.

في الوقت ذاته، تستجيب خلية أخرى بشكل أساسي للسوربيتول، حيث يتم وسم موقع بدء S TL one باللون الأخضر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وسم وتصور جزيئات mRNA الفردية في الخميرة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح في غضون يومين.

تذكر توفير تركيز كثيف بما يكفي من الخلايا، حيث تتطلب العينات المخففة تصوير وتخزين عدد أكبر من الحقول.