حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

مرحبا ، اسمي أنائيل. أعمل في مؤسسة أوزوالدو كروز في مختبر الاتصالات الخلوية. ندرس هنا مستقبلات P2 وحقن الفجوة في سياق الجهاز المناعي والكبد.

اليوم ، سأقدم لكم الحقن المجهري للخلية. تلعب حقن الفجوة بعض الأدوار الفسيولوجية مثل انتقال المشبك وتقلصات القلب وغيرها. بالنسبة لهذه التقنية ، يمكننا دراسة ما إذا كانت حقن الفجوة وظيفية أم لا.

حسنا ، دعنا نرى المكونات الأساسية لإعداد الحقن المجهري. هنا لدينا المجهر الفلوري المقلوب حيث سنرى الخلايا. هذه كاميرا CCD لتسجيل النتائج.

لدينا هنا المولد الحالي الذي سندخل الصبغة في الخلية. بعد ذلك لدينا الحامل حيث يتم توصيل القطب الصغير. والمناوير الدقيق المتصل بالحامل ويسمح بحركة القطب الصغير في المحاور الثلاثة، Z وY وX.قبل أن نبدأ التجربة، علينا أن نصنع القطب الصغير.

نحن نستخدم هذه الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات وهذه المعدات المسماة القطبية. نعلق هنا على الشعيرات الدموية البورسليكات. سنقوم بتسخين خيوط التنغستن هذه لصنع قطبين كهربائيين دقيقين.

الآن تسخين خيوط التنغستن والموجة هنا سنسحب لأسفل لصنع القطبين الصغيرين. سهل. خطوتنا الأولى هي ملء القطب الصغير بالصبغة. نصيحة واحدة هنا هي أنه يجب عليك ملء الطرف فقط ببضعة ميكرولترات لإجراء التجربة.

ليس من الضروري ملء كل شيء. ملاحظة مع مزيد من التفاصيل. املأ الطرف فقط.

لنبدأ تجربة. لدينا هنا الخلايا في طبق بتري، في محلول الصوديوم. السلك الفضي متصل بالمولد الحالي.

علينا الآن إرفاق الأقطاب الكهربائية الدقيقة في مرحلة الرأس. هنا في مرحلة الرأس لدينا سلك فضي آخر متصل أيضا بالمولد الحالي. بمجرد توصيل القطب الكهربائي الدقيق، يمكننا وضعه داخل الحمام.

لاحظ أن طرف الماصة يلامس الحمام بعناية. يتم إجراء هذا الإجراء بعناية فائقة لتجنب تحطم الطرف في قاع طبق بتري. بمجرد دخول الحمام ، يمكننا الذهاب إلى المجهر للبحث عن ظل الماصة الدقيقة.

نوصي بالبدء في البحث في عدسة التكبير. عندما نجد ظل الماصة، يمكننا تحريك القطب الصغير نحو الخلية باستخدام المعالج الدقيق. بمجرد أن يكون قريبا جدا من الخلية ، يمكننا إجراء منشور اختبار للتحقق مما إذا كان القطب الصغير غير مسدود.

كيف سنرى بعد ذلك. هنا نرى الماصة الدقيقة ونقوم بضبط الماصة الدقيقة بالقرب من الخلية. يمكننا أن نرى حركة الخلية يمينا ويسارا.

ثم نغير إلى الفلتر ، مرشح الفلورة. يمكننا تطبيق نبضة فرط الاستقطاب لاختبار ما إذا لم يتم إعاقة طرف الماصة. نظرا لأن الماصة الدقيقة موجودة داخل الخلية ، يمكننا تطبيق نبضة فرط الاستقطاب لتحميل الخلية بالصبغة.

نستخدم هنا الصبغة الصفراء الحرة السائبة. بعد تحميل الخلية بالصبغة ، إذا كانت الخلايا المجاورة متصلة عن طريق حقن الفجوة ، فإننا ننتظر بضع دقائق وسنرى الخلايا المجاورة تضيء عن طريق انتشار الصبغة عن طريق حقن الفجوة هذه. في تجربتنا يمكننا أن نرى خمس خلايا ، مميزة بالنجوم ، تظهر التألق.

يوجد هنا مثال جيد لتجربة الحقن المجهري في الخلايا الظهارية الصعترية ، في A و B.In الشكلين C و D ، يظهر حقنا مجهريا في الخلية الخاملة الصعترية من اللون الأصفر الحر السائب وصبغة أخرى ، غير قابلة للاختراق لحقن الفجوة الموضحة في الإدخال. الشكل E و F خط الخلية الظهارية الصعترية حقن مجهريا باللون الأصفر الحر السائب وفي إدراج أصفر حر فضفاض وكتلة حقن الفجوة. تظهر النتائج أن اللون الأصفر الحر السائب لم ينتشر إلى الخلايا المجاورة.

بعد ذلك نرى حقنة مجهرية في الخلايا الظهارية الصعترية ، في وجود ديكساميثازون والقياس الكمي في B.Dexamethasone زاد من درجة الاقتران ، كما هو موضح في الشكل B.من بين 100 حقنة ، كان عدد ثلاث أو أربع خلايا متصلة أكثر تواترا في وجود هذا الدواء. آمل أن أتمكن من مساعدة المبتدئين على القيام بهذه التقنية المهمة لدراسة الاتصالات الخلوية. شكرا وداعا.