التساهمية تجليد BMP-2 على السطوح باستخدام نهج أحادي الطبقة تجميعها الذاتي

نحن تصف طريقة لإنجاز الشلل كفاءة BMP-2 على السطوح. ويستند نهجنا على تشكيل أحادي الطبقة الذاتي تجميعها لتحقيق التساهمية ملزم من BMP-2 عبر مخلفاتها أمين الحرة. هذا الأسلوب هو أداة مفيدة لدراسة الإشارات في غشاء الخلية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو ربط جزيئين من BMP تساهميا بالأسطح دون فقدان نشاطهما الحيوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشكيل طبقة ذهبية أولا على الركيزة عن طريق ترسيب البخار المادي. الخطوة الثانية هي إنشاء طبقة أحادية التجميع ذاتيا من رابط NHS Thiol ثنائي الوظائف من NHSA.

بعد ذلك ، يرتبط RH BMP الثاني تساهميا بالرابط. الخطوة الأخيرة هي إزالة BMP غير المرتبط اثنين عن طريق الصوتنة. في النهاية ، يتم استخدام مقايسة ربط الأجسام المضادة لإظهار الارتباط الناجح ل BMP اثنين على الأسطح ويتم تحديد النشاط البيولوجي ل BMP المرتبط بالسطح الثاني في الخلايا عن طريق تحليل فسفرة SMA 1 5 8.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا عامل النمو ، مثل ما إذا كان الارتباط الأولي لعوامل النمو بمستقبلاتها على سطح الخلية كافيا لتحفيز استجابات الإشارات. سيظهر الإجراء عضوان من مختبري ، تيريزا بول ، وإليزابيث شواب. لبدء هذا الإجراء ، ينزلق الغطاء الزجاجي النظيف بمناديل دقيقة وصوتنة لمدة خمس دقائق في مزيج واحد لواحد من أسيتات الإيثيل والميثانول.

بعد الصوتنة ، اشطف الركائز بالميثانول وجففها تحت تدفق النيتروجين. ضع الركائز النظيفة في جهاز طلاء الرش وقم بإخلاء الغرفة. قم بإزالة طبقة أكسيد الكروم العلوية من هدف الكروم عن طريق الرش لمدة 60 ثانية.

ثم قم بتغطية الركيزة بطبقة كروم 10 نانومتر متبوعة بطبقة ذهبية 40 نانومتر. عند الانتهاء ، قم بإزالة الركائز الذهبية من الغرفة واتركها جانبا. انقل ركائز الذهب إلى قارورة قاع مستديرة ذات رقبتين واحتضانها في مللي مولار واحد M-U-N-H-S في DMF في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات تحت جو النيتروجين.

بعد الحضانة ، صوتنة الركائز في DMF لمدة دقيقتين. اشطفها باستخدام DMF والميثانول وجففها تحت تدفق النيتروجين. قم بتخفيف محلول مخزوني RHB MP بكلوريد الصوديوم المولي في PBS لإعطاء تركيز نهائي قدره 3.5 ميكروغرام لكل ملليلتر.

اضبط محلول العمل هذا على درجة الحموضة 8.5 باستخدام هيدروكسيد بوتاسيوم معقم 10 مللي مولار قبل الاستخدام مباشرة. ضع حلقة A-P-D-M-S أعلى العينة. انقل الركيزة إلى صفيحة من ستة آبار للتأكد من أن أسطح الركيزة فقط هي التي تتعرض لمحلول الحضانة.

ثم احتضان ركائز M-U-N-H-S الوظيفية باستخدام محلول العمل RHB MP الثاني عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد إزالة المادة الطافية للحضانة ، أضف كلوريد الصوديوم المولي في PBS وقم بصوتنة الركائز لمدة دقيقتين. عند الانتهاء ، اغسل الركائز ثلاث مرات بكلوريد الصوديوم المولي المعقم في PBS لمنع الامتصاص غير المحدد للجسم المضاد.

احتضان الركائز في 5٪ BSA في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الركائز بمحلول الأجسام المضادة المضادة ل BMP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند الانتهاء ، واغسل الركائز مرتين باستخدام PBS وصوتنتها لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم باحتضان الركائز في محلول الأجسام المضادة الثانوية المترافقة ب HRP لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسلها مرتين باستخدام PBS.

استخدم مقايسة الأنفلونزا الحمراء الوافرة لقياس النشاط الأنزيمي HRP عند 570 نانومتر باستخدام قارئ لوحة بذرة واحدة في 10 إلى الفم الخامس C اثنان من الأرومات العضلية C 12 لكل بئر في ستة ألواح بئر في وسط النمو واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد إزالة الألواح من الحاضنة ، قم بشفط الوسائط من الآبار وتجويع الخلايا في DMEM الخالي من المصل لمدة ثلاث إلى خمس ساعات قبل البذر على سطحي الركيزة BMP الوظيفيين للتحقيق في تحريض الإشارات على المدى القصير. استبدل الوسط ب 200 ميكرولتر من DMEM الطازج الخالي من المصل وضع ركيزتين من BMP الثابت فوق الخلايا باستخدام ملاقط ذات طرف رفيع بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قم بإزالة الركائز برفق واستنشق الوسط باستخدام ماصة. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وانتقل إلى تحليل استجابات الخلايا باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام والنشاف الغربي لتحليل النشاط البيولوجي طويل المدى. ضع الخلايا على الأسطح كما هو موضح سابقا ، وزرعها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في 2٪ FBS لمدة ستة أيام.

بعد الحضانة. قم بتصوير الخلايا عن طريق الفحص المجهري الفلوري للتحقق من RH و BMP ، وهما سطحان ملزمان يقدمان حركة RH ، و BMP ، تم تحضين اثنين ب BMP ، وجسمان مضادان محددان ، وجسم مضاد ثانوي مقترن ب HRP. تم الكشف عن السطح RH الثابت BMP الثاني أو I BMP الثاني قبل وبعد تحفيز الخلية.

يظهر هنا الارتباط الناجح ل RH BMP اثنين على السطح في تأكيد معترف به من قبل مضاد BMP اثنين IgG. تم قياس كمية السطح RH BMP الثاني باستخدام مقايسة متري الكول الأحمر لإنفلونزا أملي وتظهر البيانات أنه بعد تحفيز الخلية ، لا يزال البروتين مكتشفا على استجابات الخلية السطحية للأسطح التي تقدم RHB MP الثابت تم تقييمهما ومقارنته بتأثير ركائز الذهب غير المعالجة. هنا ، تم تحفيز خليتين C 12 لمدة 30 دقيقة بواسطة RHB MP سطحين وظيفيين يقتربان من الأعلى.

في هذا النموذج ، يمنع BMP الثاني تمايز الخلايا إلى أنابيب عضلية متعددة النوى ويحفز الأنماط الظاهرية لبانيات العظم. يتم تحليل تنشيط SMAD 1 5 8 ، وهم مراسلون نهائيون لمسار الإشارات BMP الثاني بواسطة النشاف الغربي كما هو موضح هنا. لوحظ فسفرة SM بعد 30 دقيقة من التحفيز بواسطة I BMP two ، بينما لا تحدث فسفرة SMAD 1 58 في الخلايا المعرضة لعينات الذهب غير المعالجة.

تشير هذه النتيجة إلى أن عملية الشلل لا تغير نشاطين قصير المدى في BMP وتؤدي إلى خطوات مبكرة في إشارات smad لتحديد ما إذا كان I BM P two يؤثر على التمايز العظمي على المدى الطويل. تم فحص مستوى التعبير عن الفوسفاتيز القلوي عن طريق اختبار متري كول. تم قياس نشاط الفوسفاتيز القلوي لخليتين C 12 بعد احتضان الخلايا لمدة ستة أيام على الذهب العادي وعلى سطحين IBP.

أظهر نشاط الفوسفاتيز القلوي في محللات الخلايا المزروعة على I BM P سطحين امتصاصا أعلى بكثير مقارنة بالسيطرة. تكشف هذه النتيجة أن IBMP الثاني يحفز التعبير عن الفوسفاتيز القلوي في C خليتين C 12 للتحقيق في تأثير IBP اثنين. في تكوين العضلات C ، تم طلاء خليتين من C 12 مباشرة على الذهب أو على الأسطح الوظيفية وتم زراعتهما في ظروف مصل منخفضة.

بعد ستة أيام ، تم إجراء تلطيخ سلسلة الميوسين الثقيلة كما هو موضح هنا. فشلت خلايا C 12 في تكوين أنابيب myo موجبة السلسلة الثقيلة من الميوسين في وجود I BM P اثنين على عكس الخلايا الموجودة على ركائز الذهب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تثبيت BMP الثاني على جزيئات الذهب النانوية للإجابة على أسئلة إضافية.

على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى مقدار BMP الثابت اثنين محليا لتشغيل استجابات الإشارات بكفاءة.