التحليل المنهجي لل في المختبر الخليوي المتداول باستخدام نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء دراسات دحرجة الخلايا مع زيادة الإنتاجية في ظل تدفق قص خاضع للرقابة الصارمة وذات صلة من الناحية الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظام الموائع الدقيقة متعدد الآبار حيث يتم توصيل الآبار المجاورة في صفيحة متخصصة عبر قناة ميكروفيليديك. تربط واجهة النظام مضخة كهربائية تعمل بالهواء المضغوط بالجزء العلوي من اللوحة متعددة الآبار ، وتطبق ضغطا هوائيا يدفع السائل من داخل الآبار عبر قنوات الموائع الدقيقة بمعدل تدفق محدد.

بمجرد طلاء قناة الموائع الدقيقة بالركيزة المرغوبة أو طبقة أحادية أحادية الخلية ، يتم إدخال الخلايا ذات الأهمية في قناة الموائع الدقيقة لاستكشاف تفاعلاتها المتدحرجة المحددة مع السطح المطلي ، ويمكن بعد ذلك تحليل خصائص التدحرج للخلايا أثناء تفاعلها مع الركيزة أو السطح المطلي أحادي الطبقة في ظل ظروف تجريبية مختلفة باستخدام البرنامج المناسب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل غرفة تدفق اللوحة المتوازية ، هي أن هذه التقنية تمكن من دراسة خصائص درفلة الفضة بإنتاجية أعلى بكثير تحت تدفق أنبوب يتم التحكم فيه بدقة وذات صلة من الناحية الفسيولوجية مع تقليل استهلاك الكاشف والخلايا. قد تساعد هذه المنصة في تطوير العلاجات القائمة على الخلايا الخارجية من خلال السماح بالتحليل السريع والدقيق للأساليب الهندسية المصممة للتأثير على دحرجة الخلايا وتوجيهها.

لطلاء قناة ميكروفلويديك بركيزة بروتينية ، أضف أولا 25 إلى 50 ميكرولترا من محلول البروتين المحضر حديثا في المدخل. حسنا ، قم بتطبيق قوة هائلة قدرها اثنان لكل سنتيمتر مربع لمدة خمس دقائق لتدفق المحلول في القناة. عندما تصبح حبة من السائل مرئية في المخرج ، أوقف التدفق جيدا ، واحتضن اللوحة لفترة زمنية مناسبة مع البروتين محل الاهتمام ، ثم استنشق المحلول من كل منها. حسنا.

بعد ذلك ، أضف 200 إلى 500 ميكرولتر من PBS في بئر المخرج ، ثم قم بتطبيق تدفق هائل من اثنين من المطاعم لكل سنتيمتر مربع لمدة خمس دقائق لغسل القناة لإنشاء طبقة أحادية الخلية داخل قناة الموائع الدقيقة. ابدأ بالتربسين برفق الخلايا ذات الأهمية من طبق المزرعة الخاص بها لمدة ثلاث دقائق ، وأوقف التفاعل بحجم مزدوج من الوسائط الكاملة ، ثم طرد الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 Gs و rt. بعد ذلك ، اغسل الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسائط الكاملة.

ثم أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من الوسائط الكاملة الطازجة وعدها ، واضبط محلول الخلية على التركيز المناسب ، ثم ضع 25 إلى 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل مدخل. حسنا ، ضع اللوحة الآن على مرحلة المجهر وقم بتطبيق تدفق مطلق لاثنين من العشاء لكل سنتيمتر مربع لتدفق الخلايا إلى القناة حتى يلاحظ أن الخلايا تملأ القناة بأكملها. بعد إيقاف التدفق ، املأ كل من المخرج والآبار الداخلية ب 200 ميكرولتر من الوسائط الخلوية المناسبة ، ثم اترك الخلايا تستقر وتلتصق عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ثلاث ساعات ، اغسل القناة بوسائط كاملة لإزالة الخلايا غير المرفقة. يجب أن تكون الخلايا الآن ملتقية تماما وجاهزة للاستخدام للحث على التنشيط الالتهابي للخلايا البطانية في القنوات. أضف 100 ميكرولتر من محلول TNF alpha المحضر حديثا إلى بئر المدخل ، ثم أدخل المحلول في القناة عن طريق تطبيق تدفق هائل من اثنين من الوجبات لكل سنتيمتر مربع لمدة خمس دقائق.

بالنسبة لقنوات الخلايا البطانية غير المنشطة للتحكم ، أضف 100 ميكرولتر من الوسائط القاعدية للخلية البطانية إلى المدخل. حسنا ، لمنع اختيار P أو E على سطح الخلية البطانية ، أدخل خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد المحايد المناسب في القناة واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل القنوات بوسائط قاعدية قبل البدء في اختبار التدحرج.

افحص القنوات بعناية تحت المجهر للتأكد من أن القنوات مطلية بشكل صحيح. ثم اغسل معلق خلية HL 60 بالوسائط القاعدية مرتين بعد عدد الغسيل الثاني ، ثم أعد تعليق الخلايا في IMDM بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر. بعد إضافة 25 إلى 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في المخرج ، ضع اللوحة جيدا في حامل اللوحة الذي يتم التحكم في درجة حرارته بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، وضع حامل اللوحة على مرحلة المجهر.

أدخل الخلايا في قناة الموائع الدقيقة. يجب ملاحظتها في غضون 10 إلى 15 ثانية تتدفق من المخرج إلى المدخل. هنا ، يمكن ملاحظة خلايا HL 60 المصنفة بالفلورسنت ، والتفاعل مع السطح المشفر P select ، وعرض استجابة متدحرجة لفحص استجابة التدحرج كدالة لإجهاد القص ، وتقليل القص إلى 0.25 يوميات لكل سنتيمتر مربع والحصول على مقاطع فيديو من 20 إلى 32 باستخدام وظيفة اكتساب الدفق في كل قص مطلوب ، وعن طريق زيادة القص تدريجيا من 0.25 إلى خمسة وجبات طعام لكل سنتيمتر مربع.

أخيرا ، استخدم كاميرا CCD للحصول على فيديو للفحص مع الحصول على دفق 11 إطارا في الثانية. على سبيل المثال ، هنا ، تظهر خلية HL 60 تتدحرج على طبقة أحادية من خلايا الخروج. قم بتحليل مسارات التدحرج والسرعات باستخدام البرنامج المتوافق المناسب.

تعتبر خلايا HL 60 بكرات قياسية ذهبية لأنها تعبر عن مجموعة متنوعة من الروابط الموجهة ، بما في ذلك الروابط المتدحرجة ، و P select و Glycoprotein ligand one و CI Lewis X.To اختبار قدرات نظام الموائع الدقيقة متعدد الآبار ، تم طلاء العديد من قنوات الموائع الدقيقة في وقت واحد مع ركائز مختلفة وتفاعلات التدحرج لخلايا HL 60. مع تحليل هذه الركائز ، أظهرت الخلايا سلوكا قويا متدحرجا على السطح المشفر P select مع الخلايا التي تم التقاطها لأول مرة من التدفق ، متبوعة بحركة متدحرجة مميزة. كما هو موضح في هذا الرسم البياني وبما يتفق مع الأدبيات ، تظهر خلايا HL 60 سلوكا متدحرجا مشابها على أسطح e و p selectin ، ولكن ليس على ركائز FiberInc المطلية.

تم رسم سرعة الخلية كما تم تحليلها عبر برنامج متوافق مقابل الإجهاد المطلق الذي يظهر استجابة متدحرجة قوية للخلايا على p و e selectin بمتوسط سرعة يتراوح بين واحد و 12 ميكرون في الثانية. لتقييم جدوى هذا النظام الموائع الدقيقة في اختبار التفاعلات بكفاءة بين الخلايا ذات الأهمية وطبقة أحادية الخلية التي تغطي السطح ، تم استخدام خلايا CHO P ، والتي تم نقلها للتعبير بثبات عن P ، ولكن ليس e selectin ، كما هو موضح هنا. تعرض خلايا HL 60 استجابة متدحرجة كبيرة على طبقة أحادية لخلية CHO P لاختبار ما إذا كانت حركة التدحرج ل HL 60 يتم بوساطة البكتين بالفعل.

تم تحضين الطبقة الأحادية مسبقا مع الأجسام المضادة المحظورة إما ل P أو E selectin قبل وفرة خلايا HL 60 في القناة. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، أدى حجب الطبقة الأحادية CHO p بجسم مضاد P selectin إلى انخفاض كبير في عدد خلايا HL 60 التي تتدحرج على السطح ، مما يدل على أن P يختار ويتوسط بالفعل في تدحرج HL 60. كما هو موضح سابقا ، تتكون لوحة الموائع الدقيقة متعددة الآبار من العديد من قنوات الموائع الدقيقة المنفصلة ، مما يسمح باختبار إنتاجية أعلى لعدة ظروف مختلفة.

تم استخدام هذا التصميم المفيد لصفيحة الخلايا البطانية داخل قنوات الموائع الدقيقة للتحليل السريع للتفاعلات بين خلايا HL 60 والخلايا البطانية في ظل مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية لمحاكاة الظروف الالتهابية ، تمت معالجة الخلايا البطانية مسبقا باستخدام السيتوكين المؤيد للالتهابات TNF alpha ، مما أدى إلى تنظيم E ، ولكن ليس P selectin على سطح الخلية البطانية. ومن المثير للاهتمام أن خلايا HL 60 لم تتفاعل مع الخلايا البطانية المعطلة ، ولم يلاحظ أن الخلايا تتدحرج على هذا السطح. على العكس من ذلك ، أظهرت خلايا HL 60 سلوكا قويا متدحرجا على الخلايا البطانية المنشطة من TNF alpha بمتوسط سرعة من خمسة إلى 15 ميكرون في الثانية لاستكشاف مشاركة p أو E selectin في التفاعلات المتدحرجة بين خلايا HL 60 والخلايا البطانية المنشطة.

تم تحضين الخلايا البطانية المنشطة من TNF alpha مسبقا باستخدام P أو E select في حجب الأجسام المضادة ، وتم تحليل دحرجة خلايا HL 60 كما هو موضح في الرسم البياني الذي تم تحديده على الخلايا البطانية ألفا TNF مما أدى إلى انخفاض كبير في عدد الخلايا المتدحرجة على الطبقة البطانية الأحادية المنشطة. في المقابل ، لم يكن لاستخدام التحكم في النظائر أو الجسم المضاد ضد البكتين ، والذي لا يتم التعبير عنه في الخلايا البطانية المنشطة ، تأثير كبير على تدحرج HL 60 على الطبقة البطانية المنشطة. توضح هذه البيانات المشاركة المباشرة ل S selectin في HL 60 المتداول على الخلايا البطانية المنشطة بعامل نخر الوراز ألفا بما يتفق مع التقارير السابقة.

يسمح برنامج التحليل بتتبع مسارات الخلايا الفردية أثناء تفاعلها مع السطح. وبالتالي ، تم تتبع مسارات الخلايا الفردية أثناء تفاعلها مع الخلايا البطانية المنشطة من عامل نخر الورم ألفا مع أو بدون تحديد e وحجب الأجسام المضادة على وجه التحديد كما هو موضح في هذا الشكل ، كان عدد الخلايا المتدحرجة على الخلايا البطانية المنشطة غير المسدودة أعلى بكثير من الخلايا البطانية المنشطة المنتخبة والمحظورة. علاوة على ذلك ، يبدو أن الحركة المتدحرجة لخلايا HL 60 على الخلايا البطانية غير المحظورة كانت مستمرة وقوية بينما كانت المسارات المتدحرجة للخلايا على الخلايا البطانية المنتخبة والمسدودة مجزأة.

تمشيا مع هذه النتيجة ، كانت سرعة التدحرج لخلايا HL 60 على الخلايا البطانية المنشطة من TNF alpha غير المحظورة أقل بكثير من سرعة التدحرج على الخلايا البطانية المختارة والمحظورة. توضح هذه الدراسة استخدام نظام متعدد الموائع الدقيقة لإجراء تجارب دحرجة الخلايا بكفاءة مع زيادة إنتاجية تصل إلى 10 غازات متدحرجة في الساعة تحت تدفق أنبوب خاضع للرقابة المشددة. بشكل عام ، يظهر هذا النظام الموائع الدقيقة كتقنية قوية لدراسة دحرجة الخلايا ، وهو جانب رئيسي من جوانب الخلايا.

على سبيل المثال ، يستخدم مختبرنا حاليا هذا النظام للكشف عن الظروف اللازمة لتعزيز توجيه الخلايا الجذعية الوسيطة كاستراتيجية لتحسين تأثيرها العلاجي.