طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة مورفولوجيا وديناميكيات العضيات الخلوية على مجموعة من التجاويف الدقيقة التي تحاكي البيئة ثلاثية الأبعاد التي تواجهها الظروف الفسيولوجية. بالنسبة للخلايا ذات الجدران الصلبة ، مثل الخميرة الانشطارية ، يمكن للتجاويف تنظيم وتوجيه الهياكل الخلوية. يتم تحقيق ذلك من خلال تصنيع مجموعة من أعمدة PDMS أولا من سيد للحصول على مجموعة من التجاويف الدقيقة PDMS ، والتي تسمى أكواب البيض ، عن طريق القولبة المقلدة.

كخطوة ثانية ، يتم تشغيل أكواب البيض ببروتينات المصفوفة خارج الخلية ويتم إدخالها في أنبوب بقطعة بلاستيكية أسطوانية مصنوعة حسب الطلب ، والتي تدعم عينة التجويف الدقيق وتسمح بإدخال خلايا الثدييات الفردية على كل من التجاويف الدقيقة. بعد ذلك ، تتم إزالة أكواب البيض المملوءة بالخلايا واحتضانها بالدواء أو المركب المعني من أجل دراسة النمط الظاهري والعمليات الديناميكية للخلايا في حبس ثلاثي الأبعاد. تم الحصول على النتائج التي تظهر الاختلافات في النمط الظاهري للخلية والهياكل الديناميكية الجديدة التي لوحظت عند مقارنتها بالمقايسات القياسية ثنائية الأبعاد في المختبر بناء على اتجاه الخلايا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل فحوصات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد القياسية ، هي أن خلايا الثدييات في أكواب البيض تشهد بيئة ثلاثية الأبعاد مشابهة للبيئات الدقيقة المنطقية ولكنها مرتبة في درجة مرتبة وموحدة. النظام والتوجيه هما أيضا تحسينات كبيرة في حالة الخميرة الانشطارية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الهيكل العظمي للخلايا واكتشاف الأدوية ، مثل تحديد دواء جديد ومضاد للسرطان مع فحص عالي المحتوى.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تشخيص الأمراض متعددة العوامل مثل السرطان ، لأنه يمكن بسهولة إجراء فحوصات فحص الأدوية وتحليلها عن طريق أكواب البيض ، مما يجعل هذه الطريقة مثيرة للاهتمام بشكل خاص للطب الشخصي. يمكن أن توفر هذه الطريقة مفتاحا داخليا للهياكل والديناميكيات المنظمة في خلايا الثدييات الفردية وخلايا الخميرة الانشطارية ، ويمكن أيضا تطبيقها على تنظيم الدراسة وتطوير الأجنة مثل C.elegans و ri-so-flu-a. في هذا البروتوكول ، يتم تصميم مجموعة من التجاويف الدقيقة أو أكواب البيض على طبقة بولي ديميثيل سيلوكسان أو PDMS ملتصقة على زلة غطاء عن طريق قولبة النسخة المتماثلة.

الخطوة الأولى هي تصنيع السيد ، والذي لن يتم عرضه ، ولكن يتم وصفه في بروتوكول النص. بمجرد إنشاء الرئيسي، فإن الخطوة التالية هي تصنيع النسخة المتماثلة PDMS. في أنبوب سعة 50 مليلتر ، قم بخلط الرابط المتقاطع والبوليمر المسبق جيدا في نسبة وزن إلى 10 إلى 10 أو نسبة الحجم إلى الحجم ليصبح المجموع 30 جراما.

الطرد المركزي الأنبوب عند 1 ، 800 مرة جم لمدة خمس دقائق لإزالة فقاعات الهواء. قم بإسقاط PDMS برفق فوق السيد. إذا ظهرت فقاعات ، قم بإزالة المزيج.

ضع العينة في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد علاج PDMS ، استخدم مشرطا لقطع منطقة الاهتمام برفق بحوالي سنتيمتر مربع واحد ، والتي تشمل ما يقرب من 10 إلى التجاويف الدقيقة الخامسة ، أو أكواب البيض. انزع ختم PDMS برفق.

لبدء إجراء التشكيل المتماثل ، قم بتنشيط ختم PDMS عن طريق معالجة بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. قم بتخزين الختم المنشط مؤقتا في طبق بتري مغلق لمنع ترسب الغبار. من خلال العمل في غطاء الدخان ، ضع ختم PDMS المنشط بحيث يكون الجانب بحيث تكون الهياكل متجهة لأعلى أو رأسا على عقب في طبق بتري بجوار غطاء سعة 15 مل.

املأ الغطاء ب 200 ميكرولتر من ثلاثي ميثيل كلوروسيلان. أغلق طبق بتري واترك الختم يملح لمدة سبع دقائق. ضع ختم PDMS على المغطي الدوار مع الهياكل رأسا على عقب.

ضع قطرة صغيرة من PDMS السائل فوق الهياكل. قم بتدوير الطبقة عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لإيداع طبقة رقيقة من PDMS أعلى الهياكل. ضع الختم في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات لمعالجة طبقة PDMS المغلفة بالدوران.

بعد ذلك ، قم بتنشيط طبقة PDMS الرقيقة عن طريق وضع ختم PDMS رأسا على عقب مع غطاء زجاجي في منظف بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. ضع الختم على الفور على اتصال مع زلة الغطاء الزجاجي واضغط برفق على جميع أنحاء سطح الختم باستخدام ملاقط للترابط. بعد ذلك ، حافظ على ضغط مستمر أعلى الختم لمدة 10 ثوان تقريبا.

بعد 30 دقيقة ، قشر الختم برفق من زلة الغطاء لتحرير أكواب البيض. احرص على عدم كسر العينة. اشطف أكواب البيض جيدا بالإيثانول وجففها.

إذا لم تكن أكواب بيض PDMS على انزلاق الغطاء الزجاجي وفصلها أثناء خطوة فك التثبيت ، ففكر في ضبط إعدادات منظف البلازما وأعد تشغيل إجراء التشكيل المتماثل. لتسهيل التلاعب بالعينة لاحقا ، يوصى بلصق قطعة صغيرة من PDMS المعالجة على حافة زلة الغطاء. في حالة خلايا الثدييات المعروضة في هذا الفيديو ، يجب تشغيل سطح PDMS باستخدام بروتينات الالتصاق للمصفوفة خارج الخلية.

قم بتجفيد أكواب البيض في منظف بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بتعقيم أكواب البيض بالأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. قم بإيداع قطرة صغيرة من محلول الفبرونيكتين لتغطية منطقة كوب البيض بالكامل ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

حماية العينة من التجفيف. اشطف أكواب البيض برفق بحوالي ملليلتر واحد من PBS ، باستخدام ماصة بلاستيكية. كرر ما مجموعه ثلاث مرات.

بعد ذلك ، ضع قطعة بلاستيكية أسطوانية مصنوعة حسب الطلب في أنبوب سعة 50 مل. أضف 13 مل من وسط زراعة الخلايا إلى الأنبوب. يجب أن يصل الوسيط إلى سنتيمترين على الأقل فوق القطعة الأسطوانية لضمان الانغماس الكامل للعينة.

باستخدام ملاقط حادة ومستقيمة لتثبيت العينة بمقبض PDMS ، ضع أكواب البيض بحذر داخل الأنبوب ، واضغط برفق على زلة الغطاء حتى تقع فوق الجانب العلوي من القطعة البلاستيكية وتغمر بالكامل. يجب زراعة الخلايا المراد إدخالها في أكواب البيض إلى 80 إلى 100٪ من التقاء وإعادة تعليقها في خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع. ماصة 200 ميكرولتر من الخلايا فوق أكواب البيض ، وإسقاط الخلايا في المنتصف قدر الإمكان فوق أكواب البيض ، مع تجنب الاتصال الجسدي.

سيمنع ذلك كسر و / أو تلف العينة. جهاز الطرد المركزي أنبوب 50 ملليلتر عند 1 ، 800 مرة جم لمدة دقيقتين. ماصة 200 ميكرولتر أخرى من الخلايا فوق أكواب البيض وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 1،800 مرة غرام لمدة دقيقتين.

كرر لمدة ثلاث مرات لتحسين نسبة التعبئة. بعد الطرد المركزي الأخير ، تحقق من نسبة ملء أكواب البيض بالمجهر. باستخدام الملقط لإمساك مقبض PDMS ، قم بإزالة العينة بعناية من الأنبوب دون إزعاج الخلايا الموجودة في أكواب البيض ، وضع العينة في طبق بتري متوسط

لإزالة الخلايا الزائدة غير الموجودة في أكواب البيض، اشطفها عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات بجوار كل جانب من جوانب مجموعة البنية المجهرية. أخيرا ، استبدل الوسيط بوسط جديد لإزالة الخلايا غير المرفقة. لمراقبة العضيات الخلوية الثابتة ، ضع أكواب البيض مع عينة ثابتة على مرحلة المجهر المقلوب اللفائفلوري وحدد هدف الزيت 60x.

في هذا المثال ، العينة هي الخلايا الليفية NIH 3T3 ، حيث تم تلطيخ جهاز جولجي والنواة وألياف الأكتين. ركز بعناية باستخدام ضوء المجال الساطع حتى تصبح أكواب البيض والخلايا في مستوى المراقبة. حدد منطقة الاهتمام وركز عليها وابدأ التقاط الصورة.

ابدأ هذا الإجراء بوضع أكواب البيض في حامل المجهر وتعبئته بمليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا 10٪ FCS L15. قم بتثبيت الحامل على مسرح المجهر. لتجنب التبخر ، ضع غطاء زجاجيا أعلى الحامل.

راقب الخلايا بمجهر مقلوب epifluorescence مزود بهدف زيت 60x. يستخدم هذا المثال خلايا HeLa التي تعبر عن الميوسين والأكتين الموسومين بالفلورسنت ، وهما جزيئان رئيسيان يشاركان في إغلاق الحلقة الحركية الخلوية أثناء الانقسام. حدد منطقة الاهتمام وابحث عن حلقة حركية خلوية ، باستخدام قناة GFP أو Texas Red.

التركيز بدقة. قم بتشغيل الاستحواذ التلقائي في كلتا القناتين حتى يتم إغلاق الحلقة تماما. تظهر صور المجهر الإلكتروني الماسح لأكواب البيض أن شكلها وحجمها منتظمان للغاية.

بالنسبة للخلايا ذات الجدران الصلبة مثل الخميرة الانشطارية ، يمكن لأكواب البيض توجيه الحلقة الحركية الخلوية. بالنسبة لخلايا الثدييات ، تكشف المقارنة بين الخلايا الموجودة على أكواب البيض ثلاثية الأبعاد والأسطح المسطحة ثنائية الأبعاد أن الأولى تشكل مصفوفة مرتبة مع النمط الظاهري المتجانس الشبيه بالكروية ، بينما تظهر الأخيرة مورفولوجيا مضطربة وغير متجانسة. تظهر الخلايا الموجودة على أكواب البيض أيضا انخفاضا في عدد ألياف الإجهاد ، كما يتضح من عدد التأثير المتواضع للعلاج بالبلبيستاتين.

جهاز جولجي في الثقافات ثنائية الأبعاد عادة نمطا ظاهريا ممتدا ، بينما في أكواب البيض ، يظهر نمطا ظاهريا أكثر ضغطا. تم تأكيد ذلك من خلال القياس الكمي للأنماط الظاهرية لجولجي. أخيرا ، على الأسطح ثنائية الأبعاد ، يتم توجيه نواة الخلية بشكل عشوائي ، بينما في أكواب البيض ، يتم توجيهها بشكل متعامد على المستوى xy ، في كل من النوع البري والخلايا المعالجة بالبلبيستاتين.

يكشف تحديد قيم كروية النواة أن أكواب البيض لا تؤثر على كروية نواة الخلية الطبيعية. ومع ذلك ، فإن الفرق بين النوع البري والخلايا المعالجة بالبلبيستاتين على أكواب البيض يشير إلى أن أكواب البيض تكشف عن تأثير حقيقي للدواء المقنع في 2D. تتيح دراسات الخلايا الحية باستخدام أكواب البيض تحديد العمليات النشطة الجديدة ، والتي لا يمكن رؤيتها في الثقافات القياسية.

على سبيل المثال ، لوحظت تراكمات دورية من الميوسين التي تتحرك شعاعيا مع إغلاق الحلقة الحركية الخلوية أثناء الانقسام في خلايا HeLa. بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير أكواب البيض من نسخة طبق الأصل في أقل من ست ساعات ، ويمكن ملء الخلايا في حوالي 15 دقيقة. أثناء محاولة هذه العملية ، من المهم أن يكون حجم أكواب البيض للخلايا قيد الدراسة.

يمكن تكييف هذا الإجراء بشكل أكبر مع منصات الفحص عالية المحتوى في شركات الأدوية لأنشطة الفحص الجماعي وأيضا في المقايسات التشخيصية الشخصية للمرضى في تقييم العلاجات الفردية المحددة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع واستخدام تجاويف أكواب البيض الصغيرة. تقوم أكواب البيض بتوحيد وتوليد النظام لمجموعة متنوعة من الأنظمة المماثلة ، بدءا من الخلية الفردية بدون جدران ، مثل خلايا الثدييات ، إلى النظام ذو الجدران ، مثل الخميرة والجنين.