عزل الخلوية الدهون قطرات: اثنان تقنيات تنقية بدءا من خلايا الخميرة ومشيمة الآدمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل القطيرات الدهنية من النسيج. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح وفصل نسيج المشيمة. بعد ذلك، يتم تجنيس خلايا الأولين.

بعد ذلك، يتم فصل العضيات عبر عدة خطوات من الطرد المركزي. وفي النهاية، تُجمع الطبقة العائمة التي تحتوي على القطيرات الدهنية ويتم توصيف هذه القطيرات. وأخيراً، يُستخدم المجهر الفلوري وتحليل "وسترن بلوت" (western blot) لإثبات نقاء جزء القطيرات الدهنية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية عزل القطيرات الدهنية من معظم خلايا الشريان الأورطي. يرجى ملاحظة أنه في أنسجة معينة، قد يكون عدد القطيرات أقل، مما يقلل من طبقة الطفو G وعدد القطيرات. جُمعت المشيمات من نساء أصحاء حاملات بجنين واحد خضعن لعملية قيصرية اختيارية قبل بدء المخاض التلقائي في تمام فترة الحمل، وقد قدمت المشاركات موافقة كتابية مستنيرة لجمع المشيمة الخاصة بهن.

تم إجراء عملية جمع المشيمات واستخدامها لاحقاً بعد الحصول على موافقة من جامعة تينيسي وكلية الطب للدراسات العليا بجامعة تينيس في نوكسفيل. وبناءً على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية، وفيما يلي الخطوات: داخل غطاء السلامة البيولوجية، انقل المشيمة إلى وعاء معقم قابل للتعقيم بالأتوكلاف، واغسل الدم بعناية من المشيمة والأغشية باستخدام محلول ملحي معقم. تخلص من المحلول الملحي الدموي في دورق سعة لتر واحد كنفايات بيولوجية سائلة.

ضع المشيمة على سطح معقم بحيث يكون السطح الأملس الذي يحمل الحبل السري متجهاً للأعلى، وذلك باستخدام مقص دقيق ذو طرف حاد وملقط. قم بإزالة الحبل السري والأغشية الجنينية. بعد ذلك، اقلب المشيمة بحيث يكون السطح الأمومي متجهاً للأعلى.

بعد ذلك، قم بإزالة أنسجة الصفيحة القاعدية العلوية على بُعد حوالي ثلاثة مليمترات من السطح. قم بتشريح أحد الأوعية الموصلة لـ COTA في كل مرة، مع تجنب الصفيحة الكوريونية، واجمع الأنسجة الزغبية في دورق سعة 250 milliliter يحتوي على محلول ملحي. ثم استخدم محلول ملحي sterile بتركيز 0.9% وملقط لشطف الأنسجة عدة مرات في دورق منفصل عن طريق التدوير، مع استخدام دورق سعة لتر واحد للتخلص من السوائل العادمة.

انقل شريانًا صاعدًا واحدًا في كل مرة إلى طبق بتري بقطر 150 millimeter. أمسك الشريان بملقط واستخدم شفرة حلاقة لكشط الأنسجة من الأوعية الدموية ووضعها في طبق بتري. ضع الأنسجة المكشوطة في دورق منفصل يحتوي على 0.9% sterile saline.

كرر العملية لجميع قطع الأنسجة. بعد شطف الأنسجة المكشوطة في محلول تفكيك الخلايا، قم بتصفيتها من السائل الزائد ووزنها لهضم أنسجة المشيمة. بعد تحضير خليط هضم الأنسجة، قم بتقسيم الأنسجة بنقل 60 grams من إجمالي الأنسجة المجمعة إلى دورق Helen Meyer معقم سعة 500 milliliter.

أضف خليط هضم الأنسجة إلى القارورة التي تحتوي على النسيج، ثم احضنها عند 37 degrees Celsius في جهاز هزاز لمدة 45 دقيقة. وبسرعة 150 RPM لجمع الخلايا المنفصلة بعد فترة الحضن، مع إمالة القارورة للسماح للنسيج بالترسب. ثم اجمع السائل الطافي.

يجب الحرص على عدم جمع أنسجة UND غير متفككة. أضف كمية مساوية من HBSS إلى الطافي قبل نقله إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 milliliter. كرر عملية التفكيك وجمع الطافي مع الأجزاء المتبقية من أنسجة UND المرتبطة لكل دفعة بعد إجراء عملية الطرد المركزي عند 1000 times.

يُترك المزيج للترسيب بالجاذبية لمدة 15 minutes عند درجة حرارة 4 °C، ثم تُسحب المادة الطافية دون تعكير الراسب. تتواجد خلايا الزغابات المشيمية بشكل أساسي في الجزء الأبيض من الراسب الذي يعلو خلايا الدم الحمراء. تُنقل خلايا الزغابات الموجودة في الجزء الأبيض من الراسب إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 milliliter وتُحفظ على الثلج.

بعد جمع الخلايا من مراحل الهضم الثلاث جميعها، استخدم مصفاة خلايا نايلون بمسامية 100 micron موضوعة في الجزء العلوي من أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 milliliter لترشيح المعلق. إذا تباطأت عملية ترشيح معلق الخلايا، ارفع المصفاة للأعلى لخلق فراغ داخل أنبوب الطرد المركزي، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C وبقوة 1000 ×g لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب لتجنيس خلايا الزغابات المشيمية باستخدام وسط تحلل منخفض التوتر (HLM) تم تحضيره حديثاً داخل كبينة السلامة البيولوجية، حيث تضاف كمية من HLM المثلج تعادل أربعة أضعاف حجم الراسب الخلوي إلى الخلايا.

استخدم ماصة سعة 10 milliliter لإعادة تعليق الخلايا برفق وبشكل شامل. قم بتعليق الخلايا عن طريق سحبها ودفعها للأعلى والأسفل بالماصة. بعد تحضين الخلايا على الثلج لمدة 10 minutes، انقلها إلى جهاز متجانس مبرد بالثلج، وقم بتجنيس الخلايا ببطء باستخدام مدقة فضفاضة عبر تطبيق 20 إلى 25 ضربة رقيقة.

قم بطرد المستخلص مركزياً بسرعة 3000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا غير المتكسرة. بعد ذلك، اجمع الطافي في أنبوب جديد قبل إجراء عملية طرد مركزي أخرى بسرعة 25,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. ولإزالة الميتوكوندريا وعزل القطيرات الدهنية بواسطة الطرد المركزي الفائق، اجمع الطافي في أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL.

اضبط التركيز ليكون 20% sucrose وانقله إلى قاع أنبوب جهاز الطرد المركزي الفائق المتوافق مع دوار S SW 28 أو ما يعادله، ثم غطِّ الطافي المعدل الكثافة بنحو 10 milliliters من محلول منظم كربونات الصوديوم بتركيز 100 millimolar المبرد بالثلج، ومن 0.5 إلى 1 milliliter من HLM المبرد بالثلج لملء الأنبوب. استخدم جهاز طرد مركزي بدوار S SW 28 ذو الدلاء المتأرجحة عند 130,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، اجمع الطبقة العائمة، واضبط التركيز ليكون 10% sucrose وانقلها إلى قاع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 13.2 milliliter متوافق مع دوار SW 41 TI أو ما يعادله، ثم غطِّ الطافي المعدل الكثافة بنحو 5 milliliters من محلول منظم كربونات الصوديوم بتركيز 100 millimolar المبرد بالثلج و0.5 milliliters من HLM المبرد بالثلج، ثم أجرِ عملية الطرد المركزي عند 274,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 60 دقيقة. في دوار SW 41 TI، استخدم ماصة سعة 1 milliliter لجمع الطبقة العائمة العلوية التي تحتوي على القطيرات الدهنية بعناية.

اضبط الحجم باستخدام 10% sucrose، ثم انقل الخليط مرة أخرى إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 13.2 milliliter قبل تغطيته بخمسة milliliters من sodium carbonate buffer بتركيز 100 millimolar مبرد بالثلج و 0.5 milliliters من HLM مبرد بالثلج. بعد الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة، استخدم ماصة PE منحنية لجمع الطبقة العلوية الطافية ذات اللون الأبيض التي تحتوي على القطيرات الدهنية بعناية في ثلاثة أنابيب سعة 1.5 milliliter تحتوي على 100 microliters من HLM. قم بتوصيف القطيرات الدهنية وفقاً للبروتوكول النصي كما هو موضح في هذا الشكل؛ حيث تم التحقق من وجود القطيرات الدهنية المعزولة من خلايا الزغابات السلوية البشرية عن طريق الصبغ بصبغة فلورية متخصصة للدهون المتعادلة boda P 4 93 5 0 3 ومعاينتها باستخدام المجهر الفلوري.

يظهر هنا تقييم نقاء أجزاء قطيرات الدهون المعزولة عن طريق لطخة ويسترن باستخدام بروتينات علامة لقطيرات الدهون شملت perilipin 2، وبروتين calnexin للشبكة الإندوبلازمية، والعلامة goi، و GM130 لجهاز جولجي، و COX IV للميتوكوندريا والغشاء البلازمي، و MEK1. بعد إذابة قطيرات الدهون باستخدام الأسيتون البارد واستخلاص البروتينات، خضعت الأجزاء لتحليل لطخة ويسترن لبروتين perilipin.

ثانياً، تم الكشف عن بروتين قطيرة الدهون في الطافي فوق النووي وفي الطبقة البيضاء العائمة المعزولة التي تحتوي على قطيرات الدهون. ولم يتم الكشف عن البروتينات الخاصة بالأغشية البلازمية، مثل MK one وGM one 30، في كسور قطيرات الدهون في أي من الطبقتين الموجودتين أسفل الطبقة العائمة للدورتين spin four وspin five. وكما تم الإبلاغ عنه سابقاً، فقد تم الكشف في مواضع أخرى عن بروتين calnexin وتلوين ضعيف لبروتين الغشاء الميتوكوندري CO X four في كسر قطيرات الدهون.

تتوافق هذه النتائج مع تقارير سابقة تظهر أن القطيرات الدهنية تتفاعل مع الميتوكوندريا في خلايا الثدييات ومع الشبكة الإندوبلازمية. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الطرق البروتومية والليبيدومية لدراسة أسئلة إضافية مثل العوامل المرتبطة بالقطيرات.