عزل الخلوية الدهون قطرات: اثنان تقنيات تنقية بدءا من خلايا الخميرة ومشيمة الآدمي
أبريل 1, 2014
اثنين من التقنيات لعزل قطرات الدهون الخلوية من 1) خلايا الخميرة و 2) يتم عرض مشيمة الآدمي. محور كل الإجراءات هو كثافة الطرد المركزي التدرج، حيث طبقة عائمة الناتجة تحتوي على قطرات يمكن تصور بسهولة بالعين، المستخرج، وكميا عن طريق تحليل لطخة غربية للنقاء.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل قطرات الدهون من الأنسجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح أنسجة المشيمة وفصلها أولا. بعد ذلك ، يتم تجانس خلايا الأولين.
ثم يتم فصل العضيات بعدة خطوات للطرد المركزي. أخيرا ، يتم جمع الطبقة العائمة التي تحتوي على قطرات الدهون وتمييز قطرات الدهون. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الفلوري وتحليل الدم الغربي لإظهار نقاء جزء قطرات الدهون.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من الممكن عزل قطرات الدهون من معظم خلايا الأبهر. لاحظ أنه في بعض الأنسجة ، يمكن أن يكون عدد القطرات أقل من تلك التي تقلل من طبقة G العائمة وعدد القطرات. تم جمع المشيمة من النساء الأصحاء ذوات الحمل الفردي اللواتي يخضعن للولادة القيصرية الاختيارية قبل بداية المخاض التلقائي عند الولادة الناضجة ، وأعطى الأشخاص موافقة خطية مستنيرة على جمع المشيمة.
تم جمع المشيمة واستخدامها لاحقا بموافقة من جامعة تينيسي وكلية الدراسات العليا للطب بجامعة تينيسي في نوكسفيل. لوحة المراجعة المؤسسية في غطاء السلامة البيولوجية ، ونقل المشيمة إلى حاوية معقمة قابلة للتعقيم وغسل الدم بعناية من المشيمة والأغشية باستخدام محلول ملحي معقم. تخلص من المحلول الملحي الدموي في دورق سعة لتر واحد كنفايات بيولوجية سائلة.
ضع المشيمة على حقل معقم مع هذا السطح الأملس الذي يحمل الحبل السري متجها لأعلى بمقص وملقط حاد ودقيق. إزالة الحبل السري وأغشية الجنين. بعد ذلك ، اقلب المشيمة بحيث يكون سطح الأم متجها لأعلى.
ثم قم بإزالة أنسجة الصفيحة القاعدية المغطى على بعد حوالي ثلاثة ملليمترات من السطح. قم بتشريح رصاص COTA واحد في كل مرة ، وتجنب الصفيحة المشيمية ، واجمع الأنسجة الزغبية في دورق سعة 250 مليلتر مع محلول ملحي. ثم استخدم محلول ملحي معقم 0.9٪ وملقط لشطف الأنسجة عدة مرات في دورق منفصل عن طريق التدوير باستخدام دورق سعة لتر واحد للنفايات السائلة.
انقل رصاصة كودي واحدة في كل مرة إلى طبق بتري 150 ملم. امسك بالملقط واستخدم شفرة حلاقة لكشط الأنسجة من الأوعية الدموية على طبق بتري. ضع الأنسجة المكشطة في دورق منفصل يحتوي على محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪.
كرر مع جميع قطع المناديل. بعد شطف الأنسجة المكشطة في تفكك الخلايا cve ، قم بتصريفها من السوائل الزائدة والوزن لهضم أنسجة المشيمة. بعد تحضير خليط هضم الأنسجة ، قسم الأنسجة التي تنقل 60 جراما من إجمالي الأنسجة التي تم جمعها إلى قارورة هيلين ماير المعقمة سعة 500 مل.
أضف خليط هضم الأنسجة إلى القارورة التي تحتوي على الأنسجة واحتضنه عند 37 درجة مئوية في شاكر لمدة 45 دقيقة. عند 150 دورة في الدقيقة لجمع الخلايا المنفصلة بعد الحضانة وإمالة القارورة للسماح للأنسجة بالاستقرار. اجمع السوبر ناتين.
الحرص على عدم جمع الأنسجة المنفصلة UND. أضف كمية متساوية من HBSS إلى المادة الطافية قبل نقلها إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مل. كرر التفكك وجمع المواد الطافية مع الأجزاء المتبقية من الأنسجة المرتبطة ب UND لكل دفعة بعد الطرد المركزي عند 1000 مرة.
الجاذبية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية شفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. توجد خلايا الزغابات المشيمية في الغالب في الجزء الأبيض من الحبيبات التي تغطي خلايا الدم الحمراء. انقل خلايا الزغابات في الجزء الأبيض من الحبيبات إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مليلتر واحتفظ به على الجليد.
بعد جمع الخلايا من جميع مراحل الهضم الثلاث ، استخدم مصفاة خلية نايلون 100 ميكرون يتم إدخالها في الجزء العلوي من أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مليلتر لتصفية التعليق. إذا تباطأ ترشيح تعليق الخلية ، ارفع لأعلى على المرشح لسحب فراغ داخل جهاز الطرد المركزي الأنبوبي عند أربع درجات مئوية و 1000 مرة من الجاذبية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات لتجانس خلايا الزغابات المشيمية باستخدام وسط تحلل ناقص التوتر المحضر حديثا أو HLM في غطاء أمان بيولوجي ، أضف أربعة أضعاف حجم حبيبات الخلية من HLM البارد إلى الخلايا.
استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لإعادة التدوير برفق وبدقة. قم بتعليق الخلايا عن طريق سحب ماصاتها لأعلى ولأسفل. بعد احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ، انقلها إلى الخالط البارد المثلج وقم بتجانس الخلايا ببطء باستخدام المدقة الفضفاضة عن طريق تطبيق 20 إلى 25 ضربة لطيفة.
قم بتدوير المحللة عند 3000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا غير المنقطعة. ثم اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد قبل الدوران مرة أخرى عند 25،000 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. لإزالة الميتوكوندريا لعزل قطرات الدهون عن طريق الطرد المركزي الفائق ، اجمع السوبر ناتين في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
اضبط على 20٪ من السكروز وانقله إلى قاع أنبوب الطرد المركزي الفائق لدوار S SW 28 أو تراكب مكافئ للسوبر ناتين المعدل بالكثافة مع حوالي 10 ملليلتر من البرد المثلج ، و 100 ملليمولار من كربونات الصوديوم العازلة و 0.5 إلى مليلتر واحد من HLM المثلج البارد لملء الأنبوب باستخدام جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح S SW 28 عند 130 ، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. ثم اجمع الطبقة العائمة ، واضبطها على 10٪ سكروز وانقلها إلى قاع أنبوب الطرد المركزي الفائق سعة 13.2 مليلتر لدوار SW 41 TI أو ما يعادله من التراكب الطافي المعدل الكثافة مع حوالي خمسة ملليلتر من البرد الجليدي ، و 100 مللي مولار من كربونات الصوديوم و 0.5 مل من HLM البارد المثلج بعد الطرد المركزي عند 274 ، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. في دوار SW 41 TI، استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لتجميع الطبقة العائمة العلوية التي تحتوي على قطرات دهنية بعناية.
اضبط الحجم على 10٪ سكروز وانقله مرة أخرى إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 13.2 مليلتر قبل التراكب بخمسة ملليلتر من البرد المثلج و 100 ملليمولار من كربونات الصوديوم و 0.5 مل من HLM البارد. بعد الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة ، استخدم ماصة PE مثنية لتجميع الطبقة العائمة العلوية ذات اللون الأبيض التي تحتوي على قطرات الدهون بعناية في ثلاثة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على 100 ميكرولتر من HLM. قم بتمييز قطرات الدهون وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح في هذا الشكل ، تم التحقق من وجود قطرات دهنية معزولة من خلايا الزغابات المشيمية البشرية عن طريق تلطيخها بصبغة مضان خاصة بالدهون المحايدة بودا P 4 93 5 0 3 وتصورها باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
كما هو موضح هنا ، تم تقييم نقاء كسور قطرات الدهون المعزولة عن طريق النشاف الغربي باستخدام بروتينات العلامة لقطرات الدهون التي تضمنت para lippin two calnexin ل er ، وعلامة goi ، و GM one 30 CO X four للميتوكوندريا وغشاء البلازما ، MEK واحد. بعد التدهور ، يتم استخراج قطرات الدهون مع الأسيتون البارد والبروتينات. تعرضت الكسور لشقاف غربي para lipin.
ثانيا ، تم اكتشاف بروتين قطرات الدهون في المادة الطافية بعد النووية وفي الطبقة البيضاء العائمة المعزولة التي تحتوي على قطرات دهونية. لم يتم اكتشاف البروتينات الخاصة بأغشية البلازما مثل MK one و GM one 30 في كسور قطرات الدهون في أي من الطبقتين أسفل الطبقة العائمة للدوران الرابع والدوران الخامس. كما ورد سابقا ، تم اكتشاف بروتين كالنيكسين وتلوين ضعيف لبروتين غشاء الميتوكوندريا CO X four في مكان آخر في جزء قطرات الدهون.
تتوافق هذه النتائج مع التقارير السابقة التي تظهر أن قطرات الدهون تتفاعل مع الميتوكوندريا في خلايا الثدييات ومع ER r. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الطرق البروتينية والدهون لدراسة أسئلة إضافية مثل العوامل المرتبطة بالقطرات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة تقنيات لعزل قطيرات الدهون الخلوية من خلايا الخميرة ومشيمة الإنسان باستخدام طرائق الطرد المركزي بدرجات الكثافة. يمكن بسهولة تصور و استخراج و تقدير الطبقة العائمة الناتجة التي تحتوي على القطيرات من خلال تحليل Western Blot لمعرفة النقاء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- الكيمياء الحيوية
- علم الأعصاب
الخلفية
- قطيرات الدهون هي عضيات مهمة تشارك في تخزين الدهون و التمثيل الغذائي.
- تقنيات العزل ضرورية لدراسة وظيفة و تركيب قطرات الدهون.
- الطرد المركزي بدرجات الكثافة هي طريقة شائعة لفصل المكونات الخلوية.
- يتم استخدام الميكروسكوب الفلوري وتحليل Western Blot لتقييم النقاء.
غرض الدراسة
- لعزل قطرات الدهون من أنسجة المشيمة وخلايا الخميرة.
- لتوصيف قطرات الدهون المعزولة لأبحاث لاحقة.
- لإظهار فعالية الطرد المركزي بدرجات الكثافة في هذا العملية.
الطرق المستخدمة
- تشريح وفصل أنسجة المشيمة.
- تجانس خلايا الوليين.
- فصل العضيات من خلال خطوات الطرد المركزي المتعددة.
- جمع وتحديد خصائص طبقة قطيرات الدهون العائمة.
النتائج الرئيسية
- تم عزل قطرات الدهون بنجاح من أنسجة الخميرة والأنسجة المشيمية البشرية.
- تم تأكيد نقاء كسر قطرات الدهون باستخدام تحليل Western Blot.
- قدم الميكروسكوب الفلوري تأكيداً بصرياً على قطرات الدهون.
- أظهرت الطرق إمكانية التكاثر وفعالية في عزل قطرات الدهون.
الخلاصات
- التقنيات المقدمة فعالة لعزل قطرات الدهون من الأنسجة المختلفة.
- الطرد المركزي بدرجات الكثافة هي طريقة موثوقة لهذا الغرض.
- يمكن للدراسات الإضافية استخدام قطرات الدهون المعزولة للأبحاث الأيضية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolation of lipid droplets enables mechanistic de-risking in target validation by providing purified organelles for proteomic and lipidomic analysis. This supports predictive confidence in early discovery by clarifying lipid metabolism pathways and associated protein interactions. The technique offers translational continuity from yeast models to human placental systems, facilitating cross-species target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid droplet-associated proteins to clarify functional roles in lipid storage and metabolism pathways.
- Operational Value: Provides purified lipid droplet fractions suitable for downstream proteomic and lipidomic profiling.
- Strategic Value: Supports target de-risking by isolating organelles for hypothesis testing in metabolic disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized lipid droplet preparations for consistent assay readouts in compound screening.
- Operational Value: Facilitates reproducible isolation across yeast and human cell systems, enabling platform transfer.
- Strategic Value: Supports assay standardization for lipid-modulating compound evaluation in metabolic disease programs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by enabling lipid droplet analysis in disease-relevant human placental models.
- Operational Value: Provides continuity from yeast-based mechanistic studies to human tissue validation.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in lipid-targeted therapeutic development through cross-system validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by supplying purified lipid droplets for functional analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid droplet proteome composition and lipid-protein interactions.
- Screening: Enables assay-ready lipid droplet preparations for evaluating compound effects on lipid storage.
- Analytics: Delivers quantifiable outputs via Western Blot and fluorescence microscopy for purity assessment and comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast model findings to human placental systems for metabolic pathway validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation protocol applicable across diverse eukaryotic systems for metabolic research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing ambiguity in lipid droplet-associated protein identification.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through density gradient centrifugation across model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in lipid metabolism programs by providing reliable organelle isolation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated lipid droplet proteomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell fractionation, density gradient centrifugation, and organelle isolation techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation equipment and compatible rotors (SW 28, SW 41 TI) for sucrose or Ficoll gradient separation.
- Necessitates standardization of homogenization and centrifugation parameters across yeast and human tissue preparations.
- Involves adaptation considerations for different cell types based on lipid droplet abundance and organelle contamination profiles.
- Relies on Western Blot and fluorescence microscopy for purity validation, requiring antibody availability and imaging infrastructure.
