التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

يوفر هذا البروتوكول طريقة دقيقة وقابلة للتكرار لتحديد كمي عشر فئات مختلفة من الدهون من Saccharomyces cerevisiae باستخدام طريقة استخراج واحدة وطريقة واحدة LC-MS. هذه الطريقة تسمح الكشف عن و كمية الأنواع الدهنية الأيوبريكية و isomeric لها خصائص كيميائية وفيزيائية مختلفة. لثقافة Saccharomyces cerevisiae، أولا إضافة 5 مل من محلول مخزون الجلوكوز 20٪ العقيمة لكل من اثنين من قارورة إرلينميير التي تحتوي على وسيط YNB العقيمة إلى تركيز نهائي من 2٪ الجلوكوز.

ثم، استخدام ماصة معقمة لنقل حجم من ثقافة الخميرة بين عشية وضحاها تحتوي على خمسة أضعاف عشرة إلى خلايا الخميرة السابعة في كل قارورة والثقافة القارورة لمدة 24 ساعة على الأقل في 30 درجة مئوية مع اهتزاز التناوب في 200 الثورات في الدقيقة الواحدة. لاستخراج الدهون، وتحديد العدد الإجمالي للخلايا الخميرة لكل ملليلتر من الثقافة ونقل خمسة أضعاف عشرة إلى الخلايا السابعة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة الجليد الباردة نانو نقية المياه لتحقيق حجم يصل إلى 15 مل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

إعادة تعليق بيليه الخميرة في 15 مل من الجليد البارد ايزو منشط بيكربونات العازلة للطرد المركزي الثاني وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من الجليد الطازج الباردة الأمونيوم بيكربونات الحل. في نهاية الطرد المركزي، وتخزين بيليه في 80 درجة مئوية حتى استخراج. لبدء استخراج الدهون، ذوبان بيليه الخلية على الجليد قبل إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من الماء البارد نانو نقية الجليد.

في غطاء الدخان، ونقل تعليق الخلية إلى 15 مل، وارتفاع قوة الزجاج، المسمار أعلى أنبوب الطرد المركزي مع غطاء مبطنة polytetraflufluoroethylene وإضافة 25 ميكرولترات من خليط معايير الدهون الداخلية، أعدت في 2:1 الميثانول الكلوروفورم. 100 ميكرولتر من 425 إلى 600 حمض micromolar غسلها الخرز الزجاجي و 600 ميكرولترات من الميثانول الكلوروفورم 17:1 إلى الأنبوب. دوامة الأنبوب بسرعة عالية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتعطيل الخلايا.

تليها دوامة لمدة ساعة واحدة في سرعة منخفضة في درجة حرارة الغرفة لتسهيل استخراج الدهون. في نهاية الاستخراج، احتضان العينة لمدة 15 دقيقة على الجليد، لتعزيز هطول البروتين وفصل مراحل مائي وعضوية. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينة إلى مزيد من فصل المرحلة العليا مائي من المرحلة العضوية السفلى، و, في غطاء الدخان, استخدام ماصة الزجاج البوروسيليات لنقل المرحلة العضوية السفلى إلى جديد 15 مل الزجاج عالية القوة برغي أنبوب أعلى الطرد المركزي مع غطاء مبطنة البوليتيتروفلورا.

ضع المرحلة العضوية السفلية تحت تدفق غاز النيتروجين، وفي غطاء الدخان، أضف 300 ميكرولترات من خليط الميثانول الكلوروفورم 2:1 إلى المرحلة مائي العليا المتبقية. لتسهيل فوسفاتيديكازيليسيني، فوسفاتيديلسرين، فوسفاتيديلينوسيتول والقلب والدهون استخراج دوامة الأنبوب بقوة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل الطرد المركزي للعينة. استخدام ماصة زجاجية البورسليكات لنقل المرحلة العضوية السفلى إلى المرحلة العضوية السفلى تحت النيتروجين وتتبخر المذيبات في المراحل العضوية مجتمعة في غطاء محرك الدخان.

ثم، إغلاق أنابيب من فيلم الدهون تحت تدفق غاز النيتروجين وتخزين العينات في 80 درجة مئوية. بالنسبة لكلورية اللونية السائلة، فصل الدهون المستخرجة عند 500 ميكرولترات من 63:35:5 أسيتو-نيتريل-2-بروبانول نانو نقية خليط المياه إلى أنبوب من الدهون ولفيلم دوامة ثلاث مرات لمدة عشر ثوان في دوامة في درجة حرارة الغرفة. تخضع محتويات الأنبوب لصوتينيشن بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة قبل دوامة الأنبوب ثلاث مرات لمدة عشر ثوان في دوامة كما هو موضح للتو.

نقل 100 ميكرولترers من العينة في قارورة الزجاج مع إدراج تستخدم ل24 لوحة جيدا والقضاء على أي فقاعات داخل إدراج. ضع الإدراج في بئر واحد من 24 بئراً وحمّل عمود CSH في المرحلة العكسية C18 مقروناً بعمود ما قبلي في نظام الكروماتوغرافيا السائل. تعيين درجة حرارة العمود إلى 55 درجة مئوية وتدفق إلى 300 ميكرولترس في الدقيقة الواحدة.

عندما يتم تعيين كافة المعلمات، قم بتحميل عشرة ميكرولترات من استخراج فارغة قبل تحميل العينة الأولى. ثم، فصل الأنواع الدهنية المختلفة باستخدام التدرج اللوني السائل، كما هو مبين. سيتم إنشاء مخطط كروماتوات مجموع تمثيلي من بيانات LC-MS للدهون المستخرجة من الخلايا.

بالنسبة للتحليل الطيفي الكتلي للدهون المستخرجة، قم بتحميل العينات على مطياف الكتلة المجهز بمصدر أيونات كهربائي ساخن، وحدد معلمات التحليل كما هو موضح في الجدول. استخدم محلل فورييه Transform Analyzer للكشف عن الأيونات الأصلية لـ MS-1 بدقة 60,000 وضمن النطاق الشامل للدالتون 150-2000. ثم، الكشف عن الأيونات الثانوية MS-2 باستخدام الإعدادات كما هو مبين في الجدول.

لتحديد وقياس الدهون المختلفة من ملفات LC-MS ذات الترادف العريض، ابحث في الملفات الخام LC-MS التي تحتوي على بيانات مسح كامل MS-1 وبيانات MS-2 المعتمدة للحصول على أحماض دهنية مجانية غير مُستَهدَرة، القلب والدهون، phytocerimide، phytosphyngocene، فوسفاتيديلكولين، فوسفاتيديليهولامين، phosphatydlglycerol، فوسفاتيتيدلينوليول، فوسفاتيدلسينوسيل وtriacylgcerol فئات الدهون باستخدام كتلة مقسمة على تحمل خمسة أجزاء في المليون للأيونات السلائف وعشرة أجزاء في المليون لليونات المنتج. ثم، اتبع الإرشادات الواردة في دليل المستخدم البرمجيات لتحديد معايير الدهون الداخلية وأنواع الدهون مع تكوينات الأحماض الدهنية غير عادية. هذه الطريقة الحساسة LC-MS الترادف تمكن من تحديد و كمية الأنواع الجزيئية من الدهون بتركيزات منخفضة إلى 0.165 picomolar لكل ميكرولتر.

هذا الحد من القياس الكمي يختلف عن فئات الدهون المختلفة ضمن مجموعة واسعة من التركيزات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لزيادة كفاءة التأين للدهون باستخدام إضافات المرحلة المتنقلة البديلة لقياس الطيف الكتلي المؤين للرذاذ الكهربائي. ويمكن استخدام كل من هذه الإضافات المرحلة المتنقلة البديلة لكل من المرحلة العادية وأعمدة LC المرحلة العكسية.

طريقة التفكيك الناجم عن الاصطدام مفيدة إذا استخدمت في تركيبة مع الأمونيوم المحمول خلات المرحلة المضافة لرش الكهربائية الوضع السلبي للتجريف الطيفي الشامل، كما، في ظل هذه الظروف، فإنه يسمح بزيادة في كفاءة تجزئة الدهون MS-1 إلى منتجات MS-2. في المقابل، فإن الطاقة العالية، وطريقة انفصال تصادمي مواتية إذا استخدمت في تركيبة مع الأمونيوم formate المحمول المرحلة المضافة لوسيلة إيجابية التيونية الكهربائية من القياس الطيفي الشامل كما في ظل هذه الظروف، فإنه يتيح زيادة في كفاءة تجزئة الدهون MS-1 في منتجات MS-2. لا تخلط المراحل أثناء جمع المرحلة العضوية.

إغلاق الأنابيب تحت تدفق غاز النيتروجين. القضاء على أي فقاعة داخل إدراج وربط العمود في الاتجاه الصحيح. إذا كان لا يمكن تحديد هوية أي قمة بواسطة LC-MS، يمكن استخدام MS-NMR لاستنتاج بنية هذا الجزيء.