عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا العضلية القلبية الحية من عينات بطينية بشرية مصابة وتوصيف تغيراتها الوظيفية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال الجمع السريع لعينات بطينية طازجة وتقطيعها في محلول شلل قلبي مبرد بالثلج لتجنب التحلل المفرط للأنسجة وتلف الخلايا. وتتمثل الخطوة الثانية في إجراء هضم تدريجي لقطع عضلة القلب باستخدام جهاز هضم مصمم خصيصاً ومحاليل إنزيمية.

خلال ست دورات، يتم جمع الخلايا الموجودة في المحلول المنظم في أنبوب عند كل دورة وتخفيفها باستخدام محلول لحفظ الخلايا. تتمثل الخطوة النهائية في إعادة تعليق الخلايا الموجودة في الأنابيب الستة في حجم أقل من محلول فسيولوجي قياسي بتركيزات طبيعية من الكالسيوم من أجل إجراء التوصيف الوظيفي. وفي النهاية، يُستخدم تسجيل جهد الغشاء بتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) لجهود الفعل والتقييم المتزامن للكالسيوم بين الخلايا باستخدام الأصباغ الفلورية لإظهار التغيرات في جهد الفعل، ومدة جهد الفعل، ودورة الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العضلية القلبية لدى المرضى المصابين باعتلال عضلة القلب الضخامي.

تتمثل الميزة الرئيسية لطريقة DYS unique مقارنة بطريقة 16، مثل طريقة الهضم بالقطع القياسية، في أننا نستخدم جهاز هضم مصنعاً خصيصاً بالتزامن مع محلول إنزيمي، مما يسمح بتفكيك مشترك للخلايا المتنوعة بفضل كاشطاته السيليكونية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال طب القلب، مثل كيفية انعكاس إعادة التشكيل الجزيئي والهيكلي المعروف المرتبط بأمراض القلب على تغيرات في الخلايا العضلية القلبية المفردة التي يمكن تحليلها بواسطة طريقتنا واستهدافها بأدوية محددة. لذا، تمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج الأمراض القلبية الوراثية مثل اعتلال عضلة القلب الضخامي.

في الواقع، يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار مقاربات عصبية مرضية جديدة على الخلايا العضلية القلبية البطينية من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب الضخامية أو الإقفارية والذين خضعوا لجراحة في القلب. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عند مقارنة التناظر بين عينات الشرايين البشرية والخزعات البطينية التي يتم الحصول عليها أثناء جراحة القلب. ابدأ هذا الإجراء بسكب 40 milliliters من محلول Cardioplegic في أنبوب سعة 50 milliliter واحفظه في الثلج لنقل العينة من غرفة العمليات إلى مختبر عزل الخلايا، ثم انقل العينة بسرعة إلى منطقة المختبر وابدأ في معالجة العينة في غضون 10 دقائق من استئصالها.

خذ عينة أخرى من عضلة البطين القلبية من غرفة العمليات فور استئصالها. اغسلها بمحلول CP بارد جداً واحفظها في الأنبوب مع إبقاء العينة في محلول CP المنظم البارد جداً. بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة الليفية الشغافية بعناية باستخدام مقص دقيق.

قم بتقطيع نسيج عضلة القلب إلى قطع صغيرة بطول يتراوح بين مليمترين إلى ثلاثة مليمترات، بحيث تتراوح الكمية الإجمالية من عضلة القلب البطينية بين 100 milligrams و1 gram لكل عملية عزل. بعد نقل القطع إلى غرفة الكشط في جهاز الهضم، استبدل محلول CP buffer في الغرفة بمحلول dissociation buffer بارد وخالٍ من الكالسيوم. ثم ضع جهاز الهضم في حمام مائي منظم الحرارة.

اضبط الحمام المائي على درجة حرارة 37.5 degrees Celsius وقم بتشغيله. بعد ذلك، قم بتشغيل محرك جهاز الهضم واضبط سرعة الدوران على دورة واحدة في الثانية. قم بإجراء ثلاث دورات غسيل باستخدام DB واستبدل المحلول في الغرفة بـ DB نظيف مشبع بالأكسجين عند درجة حرارة 37 degrees Celsius كل ثماني دقائق.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول إنزيمي منظم 1 بإضافة 250 units per milliliter من collagenase type five و 4 units per milliliter من protease type 24 إلى محلول DB. ثم قم بتحضير محلول إنزيمي منظم 2 بإضافة 250 units per milliliter من collagenase.

أضف خمسة من محلول DB المؤكسج EB one، وقم بتدفئته حتى 37 °C. ثم قم بإجراء دورتين من الهضم لمدة 12 دقيقة في جهاز الهضم الدوار باستخدام 3 mL من EB one المؤكسج بنسبة 100% عند 37 °C. قم بإزالة المحلول عن طريق الشفط بالماصة وتخلص منه بعد كل دورة.

بعد ذلك، قم بتجهيز ستة أنابيب سعة 15 milliliter لجمع الخلايا و80 milliliters من محلول craft brew بدرجة حرارة 4 °C لشطف محاليل EB two المؤكسجة وتسخينها لتصل إلى 37 °C. لاحقاً، قم بإجراء دورة هضم أولى لمدة 15 دقيقة باستخدام 3 milliliters من محلول EB two المؤكسج بنسبة 100% عند درجة حرارة 37 °C. وبعد انتهاء دورة الهضم، اجمع المحلول الذي يحتوي على الخلايا العضلية المرتبطة الأولى في أنبوب سعة 15 milliliter وقم بتخفيف معلق الخلايا بإضافة 12 milliliters من محلول KB البارد.

يُحفظ الأنبوب بشكل مسطح في درجة حرارة الغرفة، ثم تُجرى خمس دورات هضم أخرى لمدة 12 دقيقة باستخدام 3 mL من محلول EB عند 37 °C، ويُجمع المنظم المحتوي على الخلايا العضلية في كل دورة في أنبوب مخروطي سعة 15 mL. يجب تذكر تخفيف المنظم المجموع بحجم 3 mL باستخدام 12 mL من محلول KB في كل دورة. في النهاية، تُحفظ الأنابيب الستة التي تحتوي على الخلايا في درجة حرارة الغرفة.

في هذه الخطوة، أضف 1 mg/mL من bovine serum albumin إلى 20 mL من tyro buffer الخالي من الكالسيوم. ثم قم بترشيح المحلول، وبعد ذلك قم بطرد مركزي للأنابيب المخروطية الستة التي تحتوي على myocytes عند 100 ×g لمدة خمس دقائق. ولإجبار myocytes على الترسيب، قم بإزالة supernatant وأعد تعليق الخلايا في كل أنبوب بكمية متغيرة من TB المحتوي على BSA في درجة حرارة الغرفة.

قم بزيادة تركيز الكالسيوم تدريجيًا في الخلية التي تحتوي على المحلول المنظم عن طريق إضافة كميات صغيرة من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 100 millimolar per liter في الخطوتين الأولى والثانية. حيث يتم رفع تركيز الكالسيوم إلى 50 micro molars per liter ثم إلى 100 micro molars per liter على التوالي. تُنفذ خطوات إضافة الكالسيوم التالية كل خمس دقائق، ويتم رفع التركيز بمقدار 100 micromolar per liter في كل خطوة وصولاً إلى تركيز نهائي قدره 0.9 millimolar per liter.

لتقييم إنتاجية إجراء العزل، انقل 0.5 milliliters من المحلول المحتوي على الخلايا العضلية القلبية إلى الحجرة ذات القاعدة الزجاجية للمجهر. قم بفحص 15 حقلاً مجهرياً باستخدام عدسة شيئية بتكبير 10x واحسب النسبة المئوية للخلايا العضلية القلبية السليمة، مثل الخلايا عصوية الشكل ذات التخطيطات الواضحة والخالية من الاشتمالات الملحوظة. يجب أن تكون الإنتاجية المتوقعة في حدود 20% لإثبات التقييم الوظيفي للخلايا العضلية القلبية البشرية، بما في ذلك التسجيلات المتزامنة لجهود الفعل وتدفقات الكالسيوم داخل الخلايا.

أولاً، قم بتحضير محلول الماصة لتجارب تثبيت الرقعة (patch clamp) في تكوين الرقعة المثقبة. ثم أضف 1.8 millimolar من كلوريد الكالسيوم إلى محلول tb الخالي من الكالسيوم. استخدم هذا المحلول للإرواء السطحي للخلايا العضلية القلبية أثناء تجارب الفلورة لتثبيت الرقعة.

بعد ذلك، انقل 1 mL من معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 mL وأضف 10 µM/L من flu fort و 10 µL من power load. يتم تحضين المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع وضع الأنبوب في وضع أفقي. بعد ذلك، ضع الأنبوب في وضع رأسي واترك الخلايا تترسب لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، اسحب السائل الطافي باستخدام الماصة وأعد تعليق كتلة الخلايا في محلول tb المحتوي على الكالسيوم. انقل 25 milliliters من معلق الخلايا إلى غرفة تسجيل صغيرة مثبتة على مجهر ومتحكم في درجة حرارتها. قم بعملية التروية عن طريق الجاذبية باستخدام نظام micro fuer مسخن بمعدل تدفق 0.3 milliliters لكل دقيقة عند 37 degrees Celsius.

باستخدام جهاز سحب الماصات الدقيقة، قم بتجهيز ماصات تثبيت الرقعة (patch clamp) بقطر طرف يتراوح بين 3 إلى 5 µm ومقاومة تتراوح بين 3 إلى 4.5 MΩ عند ملئها بمحلول ps. بعد ذلك، أضف amphotericin B إلى محلول PS بتركيز 250 µg/mL واستخدمه لملء الأقطاب الكهربائية، ثم قم بتركيب القطب على حامل الماصة. بعد ذلك، اختر خلية Ron الشكل ذات التخطيطات الواضحة والخالية من الاشتمالات.

قم بتكوين الختم العملاق (giga seal) وانتظر من 5 إلى 10 دقائق حتى تنخفض مقاومة الوصول إلى أقل من 20 ohm. بعد ذلك، استحث جهود الفعل في وضع تثبيت التيار (current clamp mode) باستخدام نبضات قصيرة بترددات تحفيز مختلفة. وخلال مرحلة التسجيل، قم بتشغيل إضاءة المجال المضيء عند 492 nanometers ورصد فلورة Fluor fort عند 505 إلى 520 nanometers.

بعد ذلك، يتم الحصول على إشارات الفلورة وجهد الغشاء. يوضح هذا الشكل التغيرات في جهود الفعل في الخلايا العضلية القلبية البطينية من عينات HCM. تظهر هنا نماذج لجهود فعل متراكبة تم استحثاثها بترددات 0.2 hertz و0.5 hertz وone hertz من خلية عضلية ضابطة وخلية عضلية مصابة بـ HCM.

تظهر جهود الفعل المتراكبة بتردد 0.5 هرتز من خلية عضلية قلبية ضابطة، وذلك في حالة الغياب والحضور لـ 10⁻⁷ مولار من الإيزوبروتيرينول، وهنا يظهر الرسم التخطيطي التمثيلي لجهد الغشاء لخلية عضلية قلبية من مريض مصاب بـ HCM، والتي أظهرت العديد من إزالة الاستقطابات التلقائية، وهي إزالة استقطابات مبكرة. يوضح الشكل التغيرات في عابر الكالسيوم في الخلايا العضلية القلبية البطينية من عينات HCM.

فيما يلي تمثيل لمتراكبات عابرات الكالسيوم التي تم استحثاثها أثناء التحفيز بتردد 0.2 هرتز عبر ماصة الرقعة في خلية عضلية ضابطة وخلية مصابة بتضخم عضلة القلب hypertrophic cardiomyopathy (HCM). وتظهر حركية عابرات الكالسيوم في الخلايا العضلية القلبية المصابة بـ HCM والخلايا الضابطة في أوقات مختلفة، كما تظهر هنا الآثار الطويلة التمثيلية التي توضح الكالسيوم داخل الخلايا أثناء التحفيز بثلاثة ترددات مختلفة، مما يسلط الضوء على زيادة الكالسيوم الانبساطي عند معدلات تنبيه عالية في الخلية العضلية المصابة بـ HCM. يوضح هذا الشكل التطبيقات التجريبية الإضافية باستخدام الخلايا العضلية البطينية البشرية.

تظهر الآثار المتراكبة التمثيلية لتيار الكالسيوم من النوع L المسجل عند جهود غشائية مختلفة على اليسار، ويظهر على اليمين متوسط كثافة ذروة تيار الكالسيوم من النوع L من 18 خلية معزولة من عينات HCM عند جهود غشائية مختلفة، كما يظهر هنا أثر الكالسيوم داخل الخلايا المسجل من خلية عضلية بطينية أثناء التحفيز بالمجال الكهربائي بتردد واحد هرتز. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر بدء العملية بوقت قصير بعد جمع العينة من غرفة العمليات لضمان الجودة. يتم اتباع هذا الإجراء لعزل الخلايا العضلية القلبية البطينية البشرية. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر البؤري الحي أو الكيمياء المناعية، وسيكون هذا أمرًا حاسمًا للإجابة على أسئلة جوهرية مثل، على سبيل المثال، كيف يتغير التوضع تحت الخلوي لبنى الغشاء ووحدات تحرير الكالسيوم في أمراض القلب بعد تطورها.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق في مجال طب القلب الخلوي لدراسة الاختلالات الوظيفية في الخلايا العضلية القلبية البطينية واختبار الجدوى المحتملة لخيارات علاجية جديدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا عضلية قلبية مفردة قابلة للحياة من عينات بشرية وكيفية توصيف وظيفة الخلايا في ظروف مختلفة.