عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا عضلة القلب القابلة للحياة عن عينات البطين البشري المرضية وتوصيف تغييراتها الوظيفية. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع عينات البطين الطازجة وفرمها بسرعة أولا في محلول قلبي بارد من أجل تجنب التدهور المفرط للأنسجة وتلف الخلايا. تتمثل الخطوة الثانية في إجراء عملية هضم تدريجية لقطع عضلة القلب باستخدام جهاز هضم مخصص ومحاليل إنزيمية.

في ست دورات ، يتم جمع الخلية المحتوية على المخزن المؤقت في أنبوب في كل دورة وتخفيفها بمحلول الحفاظ على الخلية. تتمثل الخطوة الأخيرة في إعادة تعليق الخلايا الموجودة في الأنابيب الستة في حجم أقل من المحلول الفسيولوجي القياسي بتركيزات طبيعية من الكالسيوم من أجل إجراء التوصيف الوظيفي. في النهاية ، يتم استخدام تسجيل مشبك التصحيح لإمكانات العمل والتقييم المتزامن للكالسيوم بين الخلايا باستخدام الأصباغ الفلورية لإظهار التغيرات في العمل والمدة المحتملة ودورة الكالسيوم داخل الخلايا في خلايا عضلة القلب من المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب الضخامي.

الميزة الرئيسية ل DYS الفريدة من نوعها على طريقة 16 ، مثل طريقة اكتئاب القطع القياسية هي أنه في الارتباط بمحلول الإنزيم ، نستخدم جهاز هضم مخصص ، والذي يسمح بربط مشترك de للخلايا المتغيرة بفضل خدوش السيليكون. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض القلب ، مثل كيف تنعكس إعادة التشكيل الجزيئي والهيكلي المعروفة المرتبطة بأمراض القلب في تغيير خلايا عضلة القلب المفردة التي يمكن تحليلها بطريقتنا واستهدافها بواسطة أدوية معينة. لذا فإن الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى علاج أمراض القلب الوراثية مثل اعتلال عضلة القلب الضخامي.

في الواقع ، يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار مناهج الاعتلال العصبي الجديدة على خلايا عضلة القلب البطينية من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب الضخامية أو الإقفارية الذين خضعوا لجراحة في القلب. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عند مقارنة القياس بين عينات الشريان البشري والخزعات البطينية التي تم الحصول عليها أثناء جراحة القلب. ابدأ هذا الإجراء بصب 40 مل من محلول التوصيل النصفي القلبي في أنبوب سعة 50 مليلتر وتخزينه في الثلج لنقل العينة من غرفة العمليات إلى مختبر عزل الخلية ، ونقل العينة بسرعة إلى منطقة المختبر وبدء معالجة العينة في غضون 10 دقائق من استئصال

عينة عضلة القلب البطينية الجماعية التالية من غرفة العمليات مباشرة بعد الاستئصال. اغسلها بمحلول CP المثلج البارد وقم بتخزينه في الأنبوب مع الاحتفاظ بالعينة في محلول CP المثلج البارد. قم بإزالة الطبقة الليفية الشغاف بعناية باستخدام مقص ناعم بعد ذلك.

قطع أنسجة عضلة القلب إلى قطع صغيرة بطول ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات مع الكمية الإجمالية لعضلة القلب البطينية بين 100 ملليغرام وغرام واحد لكل عزلة. بعد نقل القطع إلى غرفة الكشط الخاصة بجهاز الهضم ، قم بتغيير المخزن المؤقت CP في الغرفة باستخدام عازلة تفكك باردة خالية من الكالسيوم. ثم ضع جهاز الهضم في حمام حراري.

اضبط الحمام على 37.5 درجة مئوية وقم بتشغيله. بعد ذلك ، قم بتشغيل محرك جهاز الهضم واضبط سرعة الدوران على دورة واحدة في الثانية. قم بإجراء ثلاث دورات غسيل باستخدام DB وقم بتغيير المحلول في الغرفة ب 37 درجة مئوية مشبعة بالأكسجين DB النظيفة كل ثماني دقائق.

بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت للإنزيم واحد بإضافة 250 وحدة لكل مليلتر من الكولاجيناز من النوع الخامس وأربع وحدات لكل مليلتر من البروتياز. اكتب 24 إلى حل قاعدة البيانات. ثم قم بإعداد المخزن المؤقت للإنزيم اثنين عن طريق إضافة 250 وحدة لكل مليلتر من الكولاجيناز.

اكتب خمسة إلى محلول DB أكسجة EB واحد ، وقم بتسخينه حتى 37 درجة مئوية. ثم قم بإجراء دورتين من الهضم مدة كل منهما 12 دقيقة في جهاز الهضم الدوار بثلاثة ملليلتر من EB المؤكسج بنسبة 100٪ ، واحد عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة المحلول عن طريق شفط الماصة وتخلص منه بعد كل دورة.

بعد ذلك ، قم بإعداد ستة أنابيب سعة 15 مليلتر لجمع الخلايا و 80 مل من محلول التخمير الحرفي بأربع درجات مئوية للتهرب من المخازن المؤقتة التي تؤكسج EB اثنين وتعمل حتى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإجراء أول دورة هضم مدتها 15 دقيقة بثلاثة ملليلتر من 100٪ أكسجين EB اثنين عند 37 درجة مئوية. بعد دورة الهضم ، اجمع المحلول الذي يحتوي على أول الخلايا العضلية المرتبطة في أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بتخفيف معلق الخلية ب 12 مل من محلول KB البارد.

قم بتخزين الأنبوب بشكل مسطح في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإجراء خمس دورات هضم أخرى مدتها 12 دقيقة مع ثلاثة ملليلتر من EB اثنين عند 37 درجة مئوية وجمع الخلايا العضلية المحتوية على عازلة في كل دورة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. تذكر أيضا أن تخفف المخزن المؤقت الذي تم جمعه بسعة ثلاثة ملليلتر ب 12 مل من محلول KB في كل دورة. في النهاية ، قم بتخزين الخلايا الست التي تحتوي على أنابيب في درجة حرارة الغرفة.

في هذه الخطوة ، أضف ملليغراما واحدا لكل مليلتر من ألبومين مصل الأبقار إلى 20 ملليلترا من عازلة التايرو الخالية من الكالسيوم. ثم قم بتصفية المحلول التالي ، وقم بالطرد المركزي للخلايا العضلية الستة التي تحتوي على أنابيب مخروطية عند 100 جبن لمدة خمس دقائق. لإجبار الخلايا العضلية على الاستقرار ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في كل أنبوب بكمية متغيرة من BSA تحتوي على السل في درجة حرارة الغرفة.

قم بزيادة تركيز الكالسيوم تدريجيا في الخلية المحتوية على محلول كلوريد الكالسيوم عن طريق إضافة OTTs صغيرة من محلول كلوريد الكالسيوم 100 ملليمولار لكل لتر في الخطوتين الأولى والثانية. يتم رفع تركيز الكالسيوم إلى 50 ضرسا صغيرا لكل لتر و 100 ضرس صغير لكل لتر على التوالي. يتم تنفيذ خطوات إضافة الكالسيوم التالية كل خمس دقائق ، ويتم رفع التركيز بمقدار 100 ميكرومولار لكل لتر في كل خطوة إلى تركيز نهائي يبلغ 0.9 ملليمولار لكل لتر.

لتقييم عائد إجراء العزل ، قم بنقل 0.5 مل من محلول يحتوي على الخلايا العضلية إلى الغرفة السفلية الزجاجية للمجهر. قم بتقييم 15 حقلا مجهريا عند تكبير موضوعي 10 × وحساب النسبة المئوية للخلايا العضلية السليمة مثل الخلايا على شكل قضيب ذات خطوط واضحة وبدون شوائب كبيرة. يجب أن تكون الغلة المتوقعة حوالي 20٪ لإثبات التقييم الوظيفي لخلايا عضلة القلب البشري ، بما في ذلك التسجيلات المتزامنة لإمكانات العمل وتدفقات الكالسيوم داخل الخلايا.

أولا، قم بإعداد محلول الماصة لتجارب مشبك الرقعة في تكوين الرقعة المثقبة. ثم أضف 1.8 ملليمولار من كلوريد الكالسيوم إلى السل الخالي من الكالسيوم. استخدم المحلول لنقل خلايا عضلة القلب أثناء تجارب مضان المشبك الرقعة.

بعد ذلك ، قم بنقل مليلتر واحد من تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وأضف 10 ميكرومولار لكل لتر من حصن الإنفلونزا و 10 ميكرولتر من حمل الطاقة. مركز محتضن لمدة 30 دقيقة عند ضبط درجة حرارة الغرفة في وضع أفقي. بعد ذلك ، اضبط الأنبوب في وضع رأسي واترك الخلايا لتستقر لمدة خمس دقائق.

ثم قم بإخراج المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في الكالسيوم المحتوي على السل. نقطة نقل 25 مل من تعليق الخلية إلى غرفة تسجيل صغيرة مثبتة على مجهر يتم التحكم في درجة حرارتها. يندمج بشكل فائق بالجاذبية مع نظام ميكرو فوير ساخن بمعدل تدفق 0.3 مل في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.

باستخدام مجتذب ماصة صغيرة ، قم بإعداد ماصات مشبك رقعة بقطر طرف من ثلاثة إلى خمسة ميكرومترات ومقاومة من ثلاثة إلى 4.5 ميجا أوم عند ملؤها ب ps. بعد ذلك، أضف الأمفوتريسين B إلى PS بمعدل 250 ميكروغرام لكل ملليلتر واستخدمه لملء الأقطاب الكهربائية، ثم قم بتركيب القطب الكهربائي على حامل الماصة. بعد ذلك ، حدد الخلية على شكل رون ذات خطوط واضحة وخالية من الشوائب.

قم بتشكيل ختم الجيجا وانتظر من خمس إلى 10 دقائق حتى تنخفض مقاومة الوصول إلى أقل من 20 أوم. بعد ذلك استنباط إمكانات الفعل في وضع المشبك الحالي باستخدام نبضات قصيرة بترددات مختلفة من التحفيز. أثناء مرحلة التسجيل ، قم بتشغيل إضاءة المجال الساطع عند 492 نانومتر واكتشف مضان فورت فلور عند 505 إلى 520 نانومتر.

ثم احصل على إشارات التألق والغشاء المحتمل. يوضح هذا الشكل التغيرات في إمكانات العمل في خلايا عضلة القلب البطينية من عينات HCM. فيما يلي إمكانات الفعل المتراكبة التمثيلية المستمدة عند 0.2 هرتز و 0.5 هرتز وهرتز واحد من الخلايا العضلية للتحكم والخلايا العضلية HCM.

إمكانات الفعل المتراكبة عند 0.5 هرتز من الخلايا العضلية التحكمية. في حالة عدم وجود ووجود 10 إلى سبعة إيزوبروتيرينول مولار ، وهنا هو الأثر التمثيلي لإمكانات الغشاء لخلايا عضلة القلب من مريض HCM ، والذي أظهر العديد من عمليات إزالة الاستقطاب التلقائي في وقت مبكر بعد إزالة الاستقطاب. يوضح الشكل التغيرات في الكالسيوم العابر في خلايا عضلة القلب البطينية من عينات HCM.

فيما يلي عابر الكالسيوم المتراكب التمثيلي الذي تم استبعاده أثناء التحفيز عند 0.2 هرتز عبر ماصة التصحيح في الخلايا العضلية الضابطة وخلية HCM. يتم عرض حركية عابرات الكالسيوم في HCM والتحكم في خلايا عضلة القلب في أوقات مختلفة ، وفيما يلي الآثار الطويلة التمثيلية التي تظهر الكالسيوم داخل الخلايا أثناء التحفيز بثلاثة ترددات مختلفة ، مما يسلط الضوء على زيادة الكالسيوم الانبساطي بمعدلات وتيرة عالية في الخلايا العضلية HCM. يوضح هذا الشكل التطبيقات التجريبية الإضافية باستخدام الخلايا العضلية البطينية البشرية.

الآثار التمثيلية المتراكبة التي تظهر تيار الكالسيوم من النوع L المسجل بجهد غشاء مختلف على اليسار ، ويظهر متوسط كثافة ذروة تيار الكالسيوم من النوع L من 18 خلية معزولة من عينات HCM بجهد غشاء مختلف على اليمين ويظهر هنا أثر الكالسيوم داخل الخلايا المسجل من الخلايا العضلية البطينية أثناء تحفيز المجال الكهربائي عند هرتز واحد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر بدء الإجراء بعد فترة وجيزة من جمع العينة من غرفة العمليات لضمان اتباع هذا الإجراء لعزل خلايا عضلة القلب البطينية البشرية. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري متحد البؤر لنمط الحياة أو الكيمياء المناعية ، وسيكون هذا حاسما للإجابة على الأسئلة الأساسية مثل ، على سبيل المثال ، كيف يتعثر التوطين الخلوي الفرعي لهياكل الأغشية ووحدات إطلاق الكالسيوم في أمراض القلب بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق في أمراض القلب الخلوية لدراسة التشوهات الوظيفية في خلايا عضلة القلب البطينية واختبار الفائدة المحتملة للخيارات العلاجية الجديدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا عضلة القلب المفردة القابلة للحياة عن العينات البشرية وكيفية توصيف وظيفة الخلية في ظروف مختلفة.