Name: تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: تعلم تقنية التصوير الفلوري للجزيئات المنفردة في الخلايا البكتيرية الحية. تتيح هذه الطريقة للباحثين اكتشاف وتتبع وقياس المجمعات الجزيئية الوظيفية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نعترف ان التبرعات العينية من سلالات بكتيرية من المجموعات البروفيسور جوديث ارميتاج (جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة) والبروفيسور كونراد Mullineaux (جامعة كوين ماري في لندن ، المملكة المتحدة). ويتم تمويل مشترك من جانب IMD قسم الكيمياء الحيوية (جامعة أكسفورد) وOCISB ؛ وتمول من قبل AR الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) DTC دراسية ل؛ يمول ND من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC) ؛ هو MCL بتمويل من زمالة الجمعية الملكية للبحوث الجامعة.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء هذا الإجراء ، يتم إذابة أول 50 ميكرولتر من الأسهم المجمدة للبروتين فلوري معربا عن كولاي ونمت الخلايا البكتيرية هوائيا مع اهتزاز وسائل الاعلام في 5 مل النمو LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الصباح ، ويتم استخراج 50 ميكرولتر من هذه الثقافة المشبعة وشبه مثقف إلى الحد الأدنى من وسائل الاعلام M63 ثقافة الجلوكوز ، ويحتضنها في 30 درجة مئوية لمدة 4 الى 6 ساعات. هنا نظهر باستخدام اثنين من سلالات مختلفة من الخلايا ، واحدة منها يعبر عن نقل الإلكترون السيتوكروم تنصهر لGFP ، والآخر الذي يعبر عن بروتين يشارك في المحرك في سوطي البكتيرية لتنصهر GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تحصد الخلايا إما مباشرة من ثقافة فرعية المتنامية اذا يعتبرهم عينات ظائفها ، أو أنها قد تكون المنفصمة لاقتطاع سياط البكتيرية إذا عرض في ظل ظروف &quot;المربوطة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القص ينطوي على وضع عادة 1 - 5ml ثقافة فرعية في جهاز يتكون من اثنين من المحاقن المعقمة انضم اليهم أنابيب معقمة. تتم عن طريق القص بالتناوب في كل مضخة دفع حقنة لدفع الثقافة من خلال الأنبوب الضيق. يتم ذلك 5-10 مرات ، اعتمادا على مدى القص المطلوبة. ثم يتم طرد ثقافة إلى الخلايا ، وبيليه الذي هو معلق في وسائل الإعلام الحد الأدنى لإزالة شظايا سياط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم علينا إعداد تنظيف الزجاج coverslips BK7 عن طريق غمر في محلول مشبع من كوه في الإيثانول لمدة 20 دقيقة ، ثم شطف جيدا في غير المتأينة المياه والايثانول ويترك ليجف في الهواء لمدة لا تقل عن 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبني بسيطة تدفق الخلية إلى الخلايا في منزل المجهر. وهذا ينطوي على رسم خطوط البارافين والشحوم على شريحة المجهر والزجاج BK7 ثم إنشاء نفق شطيرة من خلال وضع واحدة من coverlips تنظيف على أعلى ، والضغط برفق مع زوج من ملقط ، وإعطاء حجم الخلية تدفق ميكرولتر 50-10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة أداء وظائفها خلايا ملأنا تدفق الخلايا عن طريق الحقن بمحلول ث / ت 0.1 ٪ من بولي - L - يسين ، والسماح لها لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 دقيقة. ونحن بعد ذلك باستخدام تدفق وسائل الاعلام الحد الأدنى 100 ميكرولتر من خلال ضخ وسائل الإعلام من طرف واحد من الخلية التدفق وفتل مع المناديل الورقية من جهة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن الفتيل ثم من خلال 20 ميكرولتر من التخفيف من 1:500 قطرها 200 نانومتر المجهرية اللاتكس (Polysciences) في وسائل الإعلام الحد الأدنى للاحتفال سطح ساترة. هو مقلوب تدفق الخلايا بحيث ساترة إلى أسفل ، وضعت على منصة واضحة من سطح الرطوبة في غرفة بسيطة ، وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم تغسل حبات غير منضم بعيدا فتل من خلال وسائل الحد الأدنى من 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا أردنا أن نلاحظ أننا الخلايا المربوطة بحذف خطوة بولي - L - يسين ، وبدلا من ملء التدفق الخلوي مع 5 الأضداد المضادة للفلاجيلين ملغ / مل. تدفق الخلايا هي المكان الرطوبة في الغرفة لمدة 10 دقيقة ومن ثم من خلال مسح بواسطة فتل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ميكرولتر للثقافة الخلية ثم الشريرة من خلال الخلية التدفق ، وذلك باستخدام إما عينة المنفصمة إذا مراقبة الخلايا المربوطة أو في عرض عينة unsheared الخلايا وظائفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو مقلوب تدفق الخلايا ووضعها في غرفة لمدة 20 دقيقة الرطوبة. ثم يتم غسل الخلايا غير منضم بها فتل من خلال وسائل الحد الأدنى من 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع قطرة من زيت الغمر في وسط السطح العلوي للساترة ويوضع بعد ذلك على تدفق الخلايا برفق على لصاحب العينة من المجهر مضان مخصصة بناؤها ، مما يجعل الاتصال البصري مع فتحة عدسة رقمية عالية الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المجهر الإلكترون ضرب الكاميرا والكاميرا المقرر أن يتم تبريده إلى -70 درجة مئوية ، يتم تعيين البرنامج إلى الحصول على صور بمعدل إطار نموذجي من 25 هرتز في الإطار نقل واسطة ، disenabling مبدئيا على السيطرة على الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تبديل الإضاءة على brightfield ويتم إحضارها إلى التركيز على الصورة ، واختيار المناسب خلية أو مجموعة من الخلايا المراد تصويره على أساس تمسك يجري بالتوازي مع محورها الطويل إلى السطح ساترة. يتم ضبط دقة والتركيز على ضمان 200 نانومتر اللاتكس الخرز عالقا على السطح ساترة ليست سوى في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم الحصول على تسلسل الصور في brightfield لتسجيل الخطوط العريضة للجسم الخلية. يتم تبديل الإضاءة brightfield قبالة وتمكين الحصول على الكاميرا إلى الحد الأقصى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاقتناء باستخدام معيار إجمالي مضان التأمل الداخلي (أو TIRF) شعاع الليزر على الطول الموجي المناسب (هنا ، للأخضر الإثارة بروتين فلوري ، ونحن نستخدم الليزر نانومتر 473) غير محددة مسبقا بحيث تكون مركزة في مؤخرة الطائرة البؤرية عدسة موضوعية بل أفقيا النازحين من المحور البصري لتوليد حقل زائل عن الإثارة مضان في عينة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء اقتناء كاميرا والليزر فتح مصراع لإثارة البروتينات الفلورية داخل البكتيريا. المعلمات ليزر كثافة وسرعة اكتساب حاجة إلى أن يكون الأمثل للنظام بيولوجية معينة قيد التحقيق من قبل تجريب قيم مختلفة ، ولكن مجموعة نموذجية صelevant لدراسة مجمعات البروتين المحمول في غشاء الخلية 10-10 ميغاواط طاقة الليزر على منطقة الإثارة دائرية قطرها 30 ميكرومتر ~ ، مع زمن التعرض لكل إطار من 5-40 مللي. هي مضيئة عينات حتى photobleached ، وعادة لS. 10 ~ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام هذا البروتوكول على حد سواء لخلايا المربوطة فيها الجسم للخلية يدور حول نقطة التعلق بين ساترة وكعب سوطي ، وثبتوا للخلايا التي يتم إصلاحها بشكل صارم إلى السطح ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعض سلالات الخلايا التي لديها عدد كبير من المجمعات نسخة تستفيد من وجود مواد التبييض الأولي حيود محدودة ليزر تركز على قطب واحد من الخلية قبل TIRF التصوير. هذا ما يعادل التبييض التي تستخدم في الانتعاش بعد مضان photobleaching (أو FRAP). ويمكن استخدام المجهر عادتنا أن يتغذى بعض الإثارة في ضوء الليزر قبالة مسار مستقل عن FRAP الثانية المستعملة من نوع التبييض. عادة ما يتم استخدام 1 - 10mW قوة الليزر ، مع وقت التبييض نموذجية في نطاق 10-300 مللي. هذه النتائج في المقابل التصوير أعلى بكثير في منطقة المبيضة للخلية السماح المجمعات الفردية التي نشرها لاحقا في هذا المجال إلى أن تكون أكثر سهولة تصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور المجمعات في السيتوبلازم الخلية التي منتشر بشكل أسرع بكثير من تلك الموجودة في غشاء الخلية يعمل وضع إضاءة مختلفة تسمى &quot;slimfield&quot;. هنا يتم توسيع ليزر تركز أفقيا لتشمل مجرد خلية واحدة. هذا ينتج حقل مكثف جدا بحيث تجيز اتخاذ التعرض أسرع بكثير من ميلي ثانية واحدة a عادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على البيانات ، ويتم تغذية هذه الصور في برنامج مخصص مكتوبة (مشفرة في ابفيو (LabVIEW) 8.5). تلقائيا بالكشف عن هذه المواقف من البقع الفلورسنت في الخلايا إلى دقة عادة بضعة نانومتر ومقتطفات حجمها والسطوع. وbrightnessof ثم يتم استخدام التتبع photobleaching فيما يتعلق وقت مجمع الجزيئية مجنزرة لتقدير رياضيات الكيمياء ، أي كم من البروتينات الفلورية الفردية تشكل واحدة معقدة الجزيئية. </li></ol> ممثل النتائج : عندما يتم بشكل صحيح بروتوكول صورا لعرضها في الخلايا brightfield متميزة للغاية ، مع محيط من الهيئات زنزانة مظلمة ضد خلايا الجسم أبيض / رمادي (الشكل 1A). في الخلايا باستخدام مضان يجمد ، يمكننا أن نرى متميزة البقع كثافة من 250-300 نانومتر عادة في العرض (1B الشكل). سيتبين صحية ، والخلايا المربوطة لتدوير حول نقطة التعلق حبل brightfield في الصور. قد مضان تحت الإثارة أيضا بعض المجمعات الجزيئية في حالتنا أن ينظر في نقطة المرفق ، مما يدل على توطين البروتين المفتاحية مع المحرك سوطي. هذه البقع هي مجمعات الجزيئية الفردية ويرى عدد منهم سيتوقف على وضع الإضاءة المستخدمة وكيفية العديد من المجمعات موجودة فعلا في الخلية في أي وقت واحد. التنقل من البقع يعتمد على النظام البيولوجي محددة قيد الدراسة. إذا كانت كثافة البقع في البداية مرتفعة جدا ، كما هو الحال مع cytochromes المسمى المستخدمة هنا ، وبعد ذلك أداء التبييض FRAP الأولي يمكن تحسين التباين التصوير. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. (A) Brightfield و (ب) TIRF صورة (لون كاذبة) لخلية يجمد القولونية التعبير عن بروتين تنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) الذي يعرف أن تشارك في المحركات سوطي من البكتيريا. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.

ويجب الحرص على عدم &quot;على القص&quot; خلية للنظر في البكتيريا المربوطة ، لأن ذلك قد يضعف من وظيفة المحركات سوطي. من المهم أن استخدام الخلايا لفترة أطول من ساعة مرة واحدة على شريحة المجهر لأنها قد تصبح الأوكسجين المستنفد. قد تكون هناك حاجة كبيرة الأمثل للعثور على أفضل مجهر ظروف التصوير تهتم لنظامك البيولوجي محددة في إطار التحقيق. قد يكون من الحكمة لمحاولة تنقية التصوير باستخدام GFP وحده للتأكد من كثافة الليزر الصحيح الإثارة المطلوبة للنظام الخاص بك مجهر خاص.

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

ويمكن تحقيق الرؤية الكاملة في آليات الخلايا الحية فقط من خلال التحقيق في العمليات الرئيسية والمباشرة التي تثير الأحداث على المستوى الخلوي. إلى تاريخ القص تعقيد النظم البيولوجية تسبب دقيقة واحدة جزيء التجارب لتكون بعيدة جدا يطالبون ، والتركيز بدلا من ذلك على دراسة النظم واحد باستخدام معظم الخام نسبيا الفرقة المتوسط ​​القياسات. ومع ذلك ، العديد من العمليات الهامة تحدث في الخلية الحية على مستوى واحد فقط أو جزيئات قليلة ؛ القياسات فرقة القناع عموما الطبيعة العشوائية وغير المتجانسة من هذه الأحداث. هنا ، وذلك باستخدام المجهر الضوئي المتطورة والأدوات التحليلية لتحليل الصور ونحن لشرح كيفية رصد البروتينات داخل الخلية الحية واحد البكتيرية إلى دقة واحدة من الجزيئات ، وكيف يمكننا مراقبة ديناميكية داخل مجمعات الجزيئية في أداء الأجهزة البيولوجية. التقنيات ذات الصلة مباشرة من الناحية الفسيولوجية. فهي طفيفة ، perturbative وغير الغازية لعينة بيولوجية هي قيد الدراسة ومتفهمين تماما عن التحقيقات في المادة الحية ، وميزات لا تتوافر لنهج واحد جزيء آخر من الفيزياء الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، درس جميع العينات البيولوجية إنتاج البروتين fluorescently الموسومة على المستويات التي تكاد تكون متطابقة مع سلالات خلايا معدلة (&quot;ترميز الجينومية&quot;) ، على عكس النهج الأكثر شيوعا ولكن أقل مثالية لتوليد البروتين أكثر بكثير مما يمكن أن يحدث بشكل طبيعي (&#39;التعبير البلازميد&quot;). وبالتالي ، فإن العينات البيولوجية الفعلية التي سيتم التحقيق فيها هي أقرب إلى حد كبير في الكائنات الطبيعية ، وبالتالي المزيد من الملاحظات ذات الصلة على العمليات الفيزيولوجية الحقيقية.

نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.

لا يمكن تحقيق فهم شامل لآليات الخلايا الحية إلا من خلال استقصاء العمليات الرئيسية التي تحفز وتوجه الأحداث على المستوى الخلوي...

نوضح هنا البروتوكول الخاص بإجراء مجهرية الفلورة للجزيء الواحد على الخلايا البكتيرية الحية لتمكين الكشف عن المجمعات الجزيئية الوظيفية وتتبعها وقياسها كمياً. يبدأ هذا البروتوكول بتنمية البكتيريا التي تنتج بروتيناً مرتبطاً بجزيء صبغة فلورية. وبعد مرور أربع إلى ست ساعات، يتم استخلاص حجم صغير من الخلايا من المزرعة، ثم يتم بتر خيوط السوط لديها عن طريق القص الميكانيكي.يتم طلاء شريحة غطاء زجاجية داخل خلية تدفق للسماح للخلايا بالالتصاق بالسطح. تُحقن الخلايا في خلية التدفق ويتم ربطها عبر سويقة جيلارية، والتي يتم رصدها بالفلورة باستخدام مجهر الاستثارة بالليزر. ثم تقوم كاميرا ذات كفاءة كمية عالية بتسجيل صور الحقل المضيء والفلورة للمركبات الجزيئية الموسومة.مرحباً، اسمي إيان دوي وأعمل مع مارك لي في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة أكسفورد. أنا أليكس روبرتسون، أعمل مع مارك لي في قسم الفيزياء. أنا نيك دي من مختبر ليك، الموجود أيضاً في قسم الفيزياء.سنعرض لكم اليوم إجراء تصوير المجمعات الجزيئية المفردة في البكتيريا الحية باستخدام المجهر الفلوري المتقدم. نحن نستخدم هذا الإجراء لدراستها في حالة وظيفية، كما نستخدمه لاستقصاء الديناميكيات في الوقت الفعلي للآلات البيولوجية الطبيعية على مقياس النانومتر.دعونا نبدأ. في البداية، قم بإذابة 50 µL من سيقان مجمدة لبكتيريا e coli. لقد تم تعديل هذه البكتيريا وراثياً.لوسم بروتين بجزيء صبغة فلورية، قم بتلقيح خمسة ملليلترات من وسط نمو LB وزرع البكتيريا هوائيًا مع الرج طوال الليل عند 37 درجة مئوية. وفي صباح اليوم التالي، خذ 50 ميكرولتر من المزرعة المشبعة وانقلها إلى وسط زرع M 63 Glucose الأدنى وحضنها عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. تم استخدام سلالتين خلويتين مختلفتين هنا.يُعبر أحدهما عن سيتوكروم ناقل للإلكترونات مدمج مع GFP. بينما يُعبر الآخر عن بروتين مشارك في محرك السوط البكتيري. يمكن حصاد الخلايا المدمجة مع GFP مباشرة من المزرعة الفرعية النامية إذا كان سيتم فحصها كعينات مثبتة، أو يمكن قصها لقطع السوط البكتيري إذا كانت ستُفحص في ظروف التقييد.لقص البكتيريا، ضع من 1 إلى 5 mL من المزرعة الفرعية في جهاز يتكون من محقنتين معقمتين متصلتين بأنبوب تعقيم. قم بدفع كل محقنة بالتناوب لإجبار المزرعة على المرور عبر الأنبوب الضيق من 50 إلى 100 مرة، وذلك حسب درجة القص المطلوبة. بعد ذلك، قم بطرد مركزي للمزرعة لترسيب الخلايا، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط غذائي أدنى (minimal media) لإزالة شظايا السوط. وبمجرد تجهيز الخلايا، قم بتحضير شرائح BK 7 الزجاجية النظيفة عن طريق غمرها في محلول مشبع من هيدروكسيد البوتاسيوم والإيثانول لمدة 20 دقيقة.اشطف جيداً بالماء منزوع الأيونات والإيثانول واتركها لتجف في الهواء لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك، قم بتجهيز خلية تدفق بسيطة لاحتواء الخلايا داخل المجهر. وللقيام بذلك، ارسم خطوطاً من شمع البارافين على شريحة مجهر زجاجية من نوع BK seven، ثم كوّن هيكلاً نفقياً عن طريق وضع إحدى أغطية الشرائح التي تم تنظيفها في الأعلى.اضغط لأسفل برفق باستخدام ملقط. يجب أن ينتج عن ذلك حجم خلية تدفق يتراوح من 5 إلى 10 µL. ولملاحظة الخلايا المثبتة، املأ خلية التدفق عن طريق الحقن بمحلول بتركيز 0.1% من poly L lysine واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة على الأقل.بعد ذلك، يتم غسل خلية التدفق عن طريق حقن 100 µL من الوسط الغذائي الأدنى (minimal media) من أحد طرفي خلية التدفق، مع سحب الوسط في نفس الوقت من الطرف الآخر باستخدام ورق absorbent. بعد ذلك، يتم سحب 20 µL من تخفيف بنسبة 1:500 لكرات لاتكس مجهرية بقطر 200 nm في وسط غذائي أدنى لتعليم سطح الشريحة الغطائية. توضع خلية التدفق في غرفة ترطيب بسيطة وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يتم قلب خلية التدفق بحيث تكون الشريحة الغطائية متجهة للأسفل.ثم يتم غسل الخرزات غير المرتبطة عن طريق السحب باستخدام ورق tissue عبر 100 µL من الوسط الغذائي الأدنى. ولملاحظة الخلايا المربوطة، يتم تخطي خطوة الحضن بـ poly L lysine بدلاً من ذلك، وملء خلية التدفق بـ 5 µg/mL من محلول أجسام مضادة لـ Anti-Flag gellan، ثم وضعها في غرفة رطوبة لمدة 10 دقائق. وبعد الحضن، يتم شطف خلية التدفق عن طريق السحب باستخدام ورق tissue.بعد ذلك، يتم سحب 20 microliters من المزرعة الخلوية عبر خلية التدفق باستخدام ورق تصفية؛ حيث تُستخدم إما العينة المقصوصة لملاحظة الخلايا المقيدة أو العينة غير المقصوصة لعرض الخلايا المثبتة، ثم تُقلب خلية التدفق وتوضع في غرفة الرطوبة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، يتم غسل الخلايا غير المرتبطة عن طريق سحب 100 microliters من الوسط الغذائي الأدنى. ضع قطرة من زيت الغمر في مركز السطح العلوي لغطاء الشريحة.ضع خلية التدفق برفق فوق حامل العينة في المجهر الفلوري المصمم خصيصاً. يجب أن يؤدي ذلك إلى إحداث تلامس بصري مع العدسة الشيئية ذات الفتحة العددية العالية. بعد ذلك، قم بتشغيل كاميرا مضاعف الإلكترونات الخاصة بالمجهر واضبط الكاميرا ليتم تبريدها إلى -70 °C.تم ضبط البرنامج لالتقاط الصور بمعدل إطارات نموذجي يبلغ 25 hertz، وذلك في وضع نقل الإطارات. قم بتشغيل إضاءة المجال المضيء واضبط الصورة حتى تصبح واضحة.اختر خلية أو مجموعة من الخلايا المناسبة للتصوير بناءً على كون محورها الطولي موازياً لسطح غطاء الشريحة. اضبط التركيز للتأكد من أن حبيبات اللاتكس بحجم 200 nanometer الملتصقة بسطح غطاء الشريحة في بؤرة التركيز تماماً. قم بالتقاط تسلسل من الصور باستخدام المجال المضيء (brightfield) لتسجيل المخطط الخارجي لجسم الخلية.يتم بعد ذلك إيقاف تشغيل إضاءة المجال الساطع وتفعيل كسب الكاميرا إلى الحد الأقصى للتصوير باستخدام فلورة الانعكاس الداخلي الكلي، والمعروفة أيضاً باسم turf. ابدأ عملية التقاط الصور بالكاميرا وافتح غالق الليزر لإثارة البروتينات الفلورية داخل البكتيريا. يجب تحسين معلمات شدة الليزر وسرعة الالتقاط وفقاً للنظام البيولوجي المحدد.يتم تسليط الضوء على العينات الخاضعة للدراسة حتى حدوث التبييض الضوئي، وهو ما يستغرق عادةً حوالي 10 ثوانٍ. وبمجرد جمع البيانات، يتم إدخال الصور في برنامج تحليل مخصص، يقوم تلقائيًا بتحديد مواقع البقع الفلورية في الخلايا بدقة تصل إلى بضعة نانومترات، واستخلاص حجمها وسطوعها. ثم يُستخدم منحنى السطوع للتبييض الضوئي بالنسبة للزمن للمركب الجزيئي الجاذب لتقدير القياس الكمي (stoichiometry) المستخدم.باستخدام هذه الطريقة، تظهر صورة الخلايا التي يتم عرضها بالمجهر ذي الحقل المضيء واضحة للغاية، بحيث تكون محيطات أجسام الخلايا داكنة مقابل جسم خلوي رمادي مبيض عند استخدام الفلورة مع خلايا مثبتة. ويمكن رؤية بقع متميزة من الكثافة يتراوح عرضها عادةً من 250 إلى 300 nanometers معروضة هنا بالألوان الاصطناعية. كما يمكن رؤية الخلايا السليمة المربوطة وهي تدور حول نقطة تثبيت الربط في صور الحقل المضيء تحت الإثارة الفلورية.قد تُلاحظ أيضاً بعض المعقدات الجزيئية عند نقطة الارتباط، مما يشير إلى تموضع البروتين الملحق مع محرك Geller. تمثل هذه البقع معقدات جزيئية فردية. ويعتمد عدد هذه المعقدات المرئية على نمط الإضاءة المستخدم وعدد المعقدات الموجودة فعلياً في الخلية في أي وقت.إذا كانت كثافة البقع عالية جداً في البداية، كما هو الحال مع السيتوكرومات الموُسمة المستخدمة هنا، فإن إجراء عملية تبييض frap أولية يمكن أن يحسن تباين التصوير. تعتمد حركة البقع على النظام البيولوجي المحدد قيد الدراسة. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية تصور المجمعات الجزيئية المفردة باستخدام مجهر الفلورسنت المتقدم.عند إجراء هذه العملية، من المهم تجنب تعريض الخلايا لقوى القص، لأن ذلك قد يضعف وظيفة المحرك السوطي. ومن المهم أيضاً عدم ترك الخلايا على شرائح المجهر لأكثر من ساعة واحدة، حيث قد تنضب كمية الأكسجين المتاحة لها. وتتطلب العملية استخدام الأتمتة لإيجاد أفضل ظروف التصوير.يمكن أن يساعد استخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المنقى بمفرده في تحديد قدرة الليزر الصحيحة لنظام المجهر الخاص بك. هذا كل شيء، شكراً للمتابعة وبالتوفيق في تجاربكم.

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وقد تم تكييف هذه التقنية لتحليل مورفولوجيا CLEM التركيبية للأغشية، العضيات، والهياكل المتضررة من الجزيئات التحت خلوية microinjected. هذا الأسلوب يجمع بين تقنيات قوية من المجهرية / حقن مكروي، المجهري متحد البؤر الفلورسنت، والمجهر الإلكتروني للسماح للقرار نانومتر ملليمتر متعددة. هذه التقنية هي قابلة للطائفة واسعة من التطبيقات.

ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية

نحن تصف طريقة المجهر المتلازم الذي يجمع بين السرعة العالية 3D الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت وعالية الدقة البرد الإلكترون التصوير المقطعي. علينا أن نظهر قدرة أسلوب مترابط عن طريق التصوير الديناميكي، صغيرة HIV-1 جزيئات التفاعل مع خلايا هيلا المضيف.

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

&lt; p class = "jove_content"&gt; نوضح استخدام الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري (FPALM) لتصوير أنواع متعددة من الجزيئات المصنفة بالفلورسنت داخل الخلايا في وقت واحد. تنتج التقنيات الموصوفة توطين الآلاف إلى مئات الآلاف من البروتينات الفردية المسماة بالفلورسنت ، بدقة عشرات النانومتر داخل الخلايا المفردة.

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلوية.

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

Photoactivated المجهر التعريب (النخيل) جنبا إلى جنب مع تتبع جزيء واحد يسمح الملاحظة المباشرة والكمي للتفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا القولونية الحية.

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

ويستخدم رباعي الأبعاد (4D) التصوير لدراسة السلوك والتفاعلات بين نوعين من الإندوسومات في العيش المحطات العصبية الفقاريات. وتتميز حركة هذه الهياكل الصغيرة في ثلاثة أبعاد، والسماح تأكيد الأحداث مثل الانصهار جسيم داخلي وإيماس.

تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

يتم تطبيق أسلوب ستتحقق خفيفة الميكروسكوب الإلكتروني (كليم) للصورة التي يسببها فيروس هياكل داخل الخلية عبر الميكروسكوب الإلكتروني (م) في الخلايا التي تم تحديدها سابقا عن طريق الخفيفة الميكروسكوب (LM). وضم كنهج تصوير هجين لتحقيق رؤية متكاملة للفيروس--المضيف التفاعلات LM وم.

المجهر الإلكتروني الارتباطية الخفيفة (كليم) لتتبع وتصوير البروتينات الفيروسية المرتبطة الهياكل في الخلايا المعطل تداولها البرد

نقدم هنا دليلاً عمليا لبناء نظام متكامل الفحص المجهري، والذي يدمج التقليدية برنامج التحصين الموسع-فلوري التصوير، وتصوير فائقة جزيء واحد القرار القائم على الكشف، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار جزيء واحد التصوير، إلى إنشاء واحدة بطريقة فعالة من حيث تكلفة.

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

نقدم بروتوكول لدراسة توزيع الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic في الخلايا الكاملة بعد التعديل الجيني باستخدام الضوء المترابطة وحجم المجهر الإلكتروني بما في ذلك أسكوربات بيروكسيداز 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل، الاستئصال التسلسلي للخلايا مع وبدون الجين المستهدف في نفس القسم، والتصوير التسلسلي عن طريق المجهر الإلكتروني.

تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم

نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص Epon بعد التضمين للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باستخدام بروتين فلوري يسمى mScarlet. يمكن لهذه الطريقة الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هذه التقنية قابلة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية.

Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

يصف هذا البروتوكول آلية لاستخدام الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني لتصور تفاعل الميتوكوندريا والليزوسومات المسماة ب mEosEM و APEX2 ، على التوالي.

الضوء المرتبط ثنائي اللون والفحص المجهري الإلكتروني لتصور التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات

تعلم تقنية التصوير الفلوري للجزيئات المنفردة في الخلايا البكتيرية الحية. تتيح هذه الطريقة للباحثين اكتشاف وتتبع وقياس المجمعات الجزيئية الوظيفية بدقة عالية.

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

استكشف المزيد من الفيديوهات