تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

نوضح هنا البروتوكول الخاص بإجراء مجهرية الفلورة للجزيء الواحد على الخلايا البكتيرية الحية لتمكين الكشف عن المجمعات الجزيئية الوظيفية وتتبعها وقياسها كمياً. يبدأ هذا البروتوكول بتنمية البكتيريا التي تنتج بروتيناً مرتبطاً بجزيء صبغة فلورية. وبعد مرور أربع إلى ست ساعات، يتم استخلاص حجم صغير من الخلايا من المزرعة، ثم يتم بتر خيوط السوط لديها عن طريق القص الميكانيكي.

يتم طلاء شريحة غطاء زجاجية داخل خلية تدفق للسماح للخلايا بالالتصاق بالسطح. تُحقن الخلايا في خلية التدفق ويتم ربطها عبر سويقة جيلارية، والتي يتم رصدها بالفلورة باستخدام مجهر الاستثارة بالليزر. ثم تقوم كاميرا ذات كفاءة كمية عالية بتسجيل صور الحقل المضيء والفلورة للمركبات الجزيئية الموسومة.

مرحباً، اسمي إيان دوي وأعمل مع مارك لي في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة أكسفورد. أنا أليكس روبرتسون، أعمل مع مارك لي في قسم الفيزياء. أنا نيك دي من مختبر ليك، الموجود أيضاً في قسم الفيزياء.

سنعرض لكم اليوم إجراء تصوير المجمعات الجزيئية المفردة في البكتيريا الحية باستخدام المجهر الفلوري المتقدم. نحن نستخدم هذا الإجراء لدراستها في حالة وظيفية، كما نستخدمه لاستقصاء الديناميكيات في الوقت الفعلي للآلات البيولوجية الطبيعية على مقياس النانومتر.

دعونا نبدأ. في البداية، قم بإذابة 50 µL من سيقان مجمدة لبكتيريا e coli. لقد تم تعديل هذه البكتيريا وراثياً.

لوسم بروتين بجزيء صبغة فلورية، قم بتلقيح خمسة ملليلترات من وسط نمو LB وزرع البكتيريا هوائيًا مع الرج طوال الليل عند 37 درجة مئوية. وفي صباح اليوم التالي، خذ 50 ميكرولتر من المزرعة المشبعة وانقلها إلى وسط زرع M 63 Glucose الأدنى وحضنها عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. تم استخدام سلالتين خلويتين مختلفتين هنا.

يُعبر أحدهما عن سيتوكروم ناقل للإلكترونات مدمج مع GFP. بينما يُعبر الآخر عن بروتين مشارك في محرك السوط البكتيري. يمكن حصاد الخلايا المدمجة مع GFP مباشرة من المزرعة الفرعية النامية إذا كان سيتم فحصها كعينات مثبتة، أو يمكن قصها لقطع السوط البكتيري إذا كانت ستُفحص في ظروف التقييد.

لقص البكتيريا، ضع من 1 إلى 5 mL من المزرعة الفرعية في جهاز يتكون من محقنتين معقمتين متصلتين بأنبوب تعقيم. قم بدفع كل محقنة بالتناوب لإجبار المزرعة على المرور عبر الأنبوب الضيق من 50 إلى 100 مرة، وذلك حسب درجة القص المطلوبة. بعد ذلك، قم بطرد مركزي للمزرعة لترسيب الخلايا، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط غذائي أدنى (minimal media) لإزالة شظايا السوط. وبمجرد تجهيز الخلايا، قم بتحضير شرائح BK 7 الزجاجية النظيفة عن طريق غمرها في محلول مشبع من هيدروكسيد البوتاسيوم والإيثانول لمدة 20 دقيقة.

اشطف جيداً بالماء منزوع الأيونات والإيثانول واتركها لتجف في الهواء لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك، قم بتجهيز خلية تدفق بسيطة لاحتواء الخلايا داخل المجهر. وللقيام بذلك، ارسم خطوطاً من شمع البارافين على شريحة مجهر زجاجية من نوع BK seven، ثم كوّن هيكلاً نفقياً عن طريق وضع إحدى أغطية الشرائح التي تم تنظيفها في الأعلى.

اضغط لأسفل برفق باستخدام ملقط. يجب أن ينتج عن ذلك حجم خلية تدفق يتراوح من 5 إلى 10 µL. ولملاحظة الخلايا المثبتة، املأ خلية التدفق عن طريق الحقن بمحلول بتركيز 0.1% من poly L lysine واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة على الأقل.

بعد ذلك، يتم غسل خلية التدفق عن طريق حقن 100 µL من الوسط الغذائي الأدنى (minimal media) من أحد طرفي خلية التدفق، مع سحب الوسط في نفس الوقت من الطرف الآخر باستخدام ورق absorbent. بعد ذلك، يتم سحب 20 µL من تخفيف بنسبة 1:500 لكرات لاتكس مجهرية بقطر 200 nm في وسط غذائي أدنى لتعليم سطح الشريحة الغطائية. توضع خلية التدفق في غرفة ترطيب بسيطة وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يتم قلب خلية التدفق بحيث تكون الشريحة الغطائية متجهة للأسفل.

ثم يتم غسل الخرزات غير المرتبطة عن طريق السحب باستخدام ورق tissue عبر 100 µL من الوسط الغذائي الأدنى. ولملاحظة الخلايا المربوطة، يتم تخطي خطوة الحضن بـ poly L lysine بدلاً من ذلك، وملء خلية التدفق بـ 5 µg/mL من محلول أجسام مضادة لـ Anti-Flag gellan، ثم وضعها في غرفة رطوبة لمدة 10 دقائق. وبعد الحضن، يتم شطف خلية التدفق عن طريق السحب باستخدام ورق tissue.

بعد ذلك، يتم سحب 20 microliters من المزرعة الخلوية عبر خلية التدفق باستخدام ورق تصفية؛ حيث تُستخدم إما العينة المقصوصة لملاحظة الخلايا المقيدة أو العينة غير المقصوصة لعرض الخلايا المثبتة، ثم تُقلب خلية التدفق وتوضع في غرفة الرطوبة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، يتم غسل الخلايا غير المرتبطة عن طريق سحب 100 microliters من الوسط الغذائي الأدنى. ضع قطرة من زيت الغمر في مركز السطح العلوي لغطاء الشريحة.

ضع خلية التدفق برفق فوق حامل العينة في المجهر الفلوري المصمم خصيصاً. يجب أن يؤدي ذلك إلى إحداث تلامس بصري مع العدسة الشيئية ذات الفتحة العددية العالية. بعد ذلك، قم بتشغيل كاميرا مضاعف الإلكترونات الخاصة بالمجهر واضبط الكاميرا ليتم تبريدها إلى -70 °C.

تم ضبط البرنامج لالتقاط الصور بمعدل إطارات نموذجي يبلغ 25 hertz، وذلك في وضع نقل الإطارات. قم بتشغيل إضاءة المجال المضيء واضبط الصورة حتى تصبح واضحة.

اختر خلية أو مجموعة من الخلايا المناسبة للتصوير بناءً على كون محورها الطولي موازياً لسطح غطاء الشريحة. اضبط التركيز للتأكد من أن حبيبات اللاتكس بحجم 200 nanometer الملتصقة بسطح غطاء الشريحة في بؤرة التركيز تماماً. قم بالتقاط تسلسل من الصور باستخدام المجال المضيء (brightfield) لتسجيل المخطط الخارجي لجسم الخلية.

يتم بعد ذلك إيقاف تشغيل إضاءة المجال الساطع وتفعيل كسب الكاميرا إلى الحد الأقصى للتصوير باستخدام فلورة الانعكاس الداخلي الكلي، والمعروفة أيضاً باسم turf. ابدأ عملية التقاط الصور بالكاميرا وافتح غالق الليزر لإثارة البروتينات الفلورية داخل البكتيريا. يجب تحسين معلمات شدة الليزر وسرعة الالتقاط وفقاً للنظام البيولوجي المحدد.

يتم تسليط الضوء على العينات الخاضعة للدراسة حتى حدوث التبييض الضوئي، وهو ما يستغرق عادةً حوالي 10 ثوانٍ. وبمجرد جمع البيانات، يتم إدخال الصور في برنامج تحليل مخصص، يقوم تلقائيًا بتحديد مواقع البقع الفلورية في الخلايا بدقة تصل إلى بضعة نانومترات، واستخلاص حجمها وسطوعها. ثم يُستخدم منحنى السطوع للتبييض الضوئي بالنسبة للزمن للمركب الجزيئي الجاذب لتقدير القياس الكمي (stoichiometry) المستخدم.

باستخدام هذه الطريقة، تظهر صورة الخلايا التي يتم عرضها بالمجهر ذي الحقل المضيء واضحة للغاية، بحيث تكون محيطات أجسام الخلايا داكنة مقابل جسم خلوي رمادي مبيض عند استخدام الفلورة مع خلايا مثبتة. ويمكن رؤية بقع متميزة من الكثافة يتراوح عرضها عادةً من 250 إلى 300 nanometers معروضة هنا بالألوان الاصطناعية. كما يمكن رؤية الخلايا السليمة المربوطة وهي تدور حول نقطة تثبيت الربط في صور الحقل المضيء تحت الإثارة الفلورية.

قد تُلاحظ أيضاً بعض المعقدات الجزيئية عند نقطة الارتباط، مما يشير إلى تموضع البروتين الملحق مع محرك Geller. تمثل هذه البقع معقدات جزيئية فردية. ويعتمد عدد هذه المعقدات المرئية على نمط الإضاءة المستخدم وعدد المعقدات الموجودة فعلياً في الخلية في أي وقت.

إذا كانت كثافة البقع عالية جداً في البداية، كما هو الحال مع السيتوكرومات الموُسمة المستخدمة هنا، فإن إجراء عملية تبييض frap أولية يمكن أن يحسن تباين التصوير. تعتمد حركة البقع على النظام البيولوجي المحدد قيد الدراسة. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية تصور المجمعات الجزيئية المفردة باستخدام مجهر الفلورسنت المتقدم.

عند إجراء هذه العملية، من المهم تجنب تعريض الخلايا لقوى القص، لأن ذلك قد يضعف وظيفة المحرك السوطي. ومن المهم أيضاً عدم ترك الخلايا على شرائح المجهر لأكثر من ساعة واحدة، حيث قد تنضب كمية الأكسجين المتاحة لها. وتتطلب العملية استخدام الأتمتة لإيجاد أفضل ظروف التصوير.

يمكن أن يساعد استخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المنقى بمفرده في تحديد قدرة الليزر الصحيحة لنظام المجهر الخاص بك. هذا كل شيء، شكراً للمتابعة وبالتوفيق في تجاربكم.