تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم
September 8th, 2009
نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.
نوضح هنا بروتوكول إجراء الفحص المجهري الفلوري لجزيء واحد على الخلايا البكتيرية الحية لتمكين اكتشاف المجمعات الجزيئية الوظيفية وتتبعها وتحديدها كميا. يبدأ هذا البروتوكول بالبكتيريا النامية ، والتي تصنع بروتينا مميزا بجزيء صبغة الفلورسنت. بعد أربع إلى ست ساعات ، يتم استخراج كمية صغيرة من الخلايا من المزرعة ويتم اقتطاع خيوطها عن طريق القص.
يتمطلاء زلة الغطاء الزجاجي داخل خلية التدفق للسماح للخلايا بالالتصاق بالسطح. يتم حقن الخلايا في خلية التدفق وربطها عبر كعب جيلار ، والذي يتم عرضه في التألق باستخدام الفحص المجهري للإثارة بالليزر. ثم تسجل الكاميرا عالية الكفاءة الكمومية الصور الساطعة والصور الفلورية الساطعة للمجمعات الجزيئية الموسومة.
مرحبا ، اسمي إيان دوي وأنا أعمل مع مارك لي في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة أكسفورد. أنا أليكس روبرتسون أعمل مع مارك لي في قسم الفيزياء. أنا دي من مختبر التسرب ، ومقره أيضا في قسم الفيزياء.
سنعرض لكم اليوم إجراء تصور المجمعات الجزيئية المفردة في البكتيريا الحية باستخدام الفحص المجهري الفلوري المتقدم. نستخدم هذا الإجراء لدراستهإلى هذا في حالة وظيفية. نحن نستخدم أيضا للتحقيق في ديناميكيات الوقت الفعلي للآلة البيولوجية الطبيعية ومقياس العدسة النانومترية.
لذلك دعونا نبدأ. للبدء ، قم بإذابة 50 ميكرولترا من السيقان المجمدة من بكتيريا الإشريكية القولونية. تم تعديلها وراثيا.
لتمييز البروتين بجزيء صبغة الفلورسنت ، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من وسائط نمو LB وقم بزراعة البكتيريا التي تهتز هوائية طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، خذ 50 ميكرولترا من الثقافة المشبعة وزرعها في الحد الأدنى من وسائط زراعة الجلوكوز M 63 تحتضن عند 30 درجة مئوية لمدة أربع إلى ست ساعات. هنا يتم استخدام سلالتين مختلفتين من الخلية.
واحدة يعبر عن إلكترون ينقل سيتوكروم ينصهر إلى [غفب]. الآخر يعبر عن بروتين مشارك في محرك السوط البكتيري. يمكن إما أن يتم حصاد الخلايا المدمجة في GFP مباشرة من الثقافة الفرعية المتنامية إذا كان سيتم النظر إليها على أنها عينات ثابتة ، أو قد يتم قصها لاقتطاع السوط البكتيري إذا تم عرضها في ظل ظروف مربوطة.
لقص البكتيريا ، ضع ملليلترا إلى خمسة ملليلتر من المزرعة الفرعية في جهاز يتكون من حقنتين معقمتين بواسطة أنابيب معقمة. الدفع البديل في كل مضخة حقنة لإجبار المزرعة عبر الأنبوب الضيق حوالي 50 إلى 100 مرة اعتمادا على مدى القص المكتسب بعد ذلك الطرد المركزي المزرعة لحبيبات الخلايا ثم إعادة تعليق الخلايا في الحد الأدنى من الوسائط لإزالة شظايا السوط. بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة ، قم بإعداد سبعة زلات غطاء زجاجي BK النظيفة عن طريق غمرها في محلول مشبع من هيدروكسيد البوتاسيوم والإيثانول لمدة 20 دقيقة.
اشطفها جيدا بالماء منزوع الأيونات والإيثانول واتركها حتى تجف في الهواء لمدة ساعة على الأقل. بعد ذلك ، قم ببناء خلية تدفق بسيطة لإيواء الخلايا في المجهر. للقيام بذلك ، ارسم خطوطا من شحم البارافين على شريحة مجهر زجاجي BK سبعة ، ثم قم بإنشاء شطيرة نفق عن طريق وضع إحدى زلات الغطاء النظيفة في الأعلى.
اضغط برفق باستخدام ملقط. يجب أن يعطي هذا حجم خلية تدفق من خمسة إلى 10 ميكرولترات. لمراقبة الخلايا الجمودة ، املأ خلية التدفق عن طريق الحقن بمحلول 0.1٪ من بولي L يسين والسماح لها بالحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
بعد ذلك ، قم بإخراج خلية التدفق عن طريق حقن 100 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط من أحد طرفي خلية التدفق وفي نفس الوقت فتيل الوسائط من خلال خلية التدفق بمناديل ورقية من الطرف الآخر بعد ذلك ، ألقى WIC 20 ميكرولترا من واحد في 500 تخفيف من الكريات المجهرية اللاتكس بقطر 200 نانومتر في الحد الأدنى من الوسائط لتمييز سطح انزلاق الغطاء. ضع خلية التدفق في غرفة رطوبة بسيطة واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يتم قلب خلية التدفق بحيث يكون انزلاق الغطاء متجها لأسفل.
ثم يتم غسل الخرزات غير المقيدة عن طريق فتل 100 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط باستخدام المناديل الورقية. لمراقبة الخلايا المربوطة ، تخطي خطوة حضانة بولي L lysine بدلا من ذلك ، واملأ خلية التدفق بخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من محلول الأجسام المضادة للجيلان المضاد للعلم ، ثم ضعه في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، اغسل خلية التدفق عن طريق فتل المناديل الورقية.
بعد ذلك ، WIC 20 ميكرولترا من ثقافة الخلية من خلال خلية التدفق مع المناديل الورقية ، إما باستخدام العينة المنفصمة لمراقبة الخلايا المربوطة أو العينة غير المشتركة لعرض الخلايا المجمدة ، يتم قلب خلية التدفق ووضعها في غرفة الرطوبة لمدة 20 دقيقة. ثم يتم غسل الخلايا غير المنضجة عن طريق فتل 100 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط. ضع قطرة من زيت الغمر في وسط السطح العلوي لزلة الغطاء.
ضع خلية التدفق برفق على حامل العينة لمجهر التألق المخصص. يجب أن يؤدي هذا إلى اتصال بصري مع العدسة الموضوعية ذات الفتحة العددية العالية. بعد ذلك ، قم بتشغيل كاميرا مضاعفة الإلكترون بالمجهر واضبط الكاميرا ليتم تبريدها على 70 درجة مئوية تحت الصفر.
تم تعيين البرنامج للحصول على صور بمعدل إطارات نموذجي يبلغ 25 هرتز. في وضع نقل الإطارات. قم بتشغيل إضاءة المجال الساطع واجعل الصورة في نطاق التركيز.
حدد خلية مناسبة أو مجموعة من الخلايا ليتم تصويرها على أساس كونها عالقة بمحورها الطويل. بالتوازي مع سطح انزلاق الغطاء، اضبط التركيز للتأكد من أن حبات اللاتكس 200 نانومتر الملتصقة بسطح انزلاق الغطاء في بؤرة التركيز فقط. احصل على تسلسل صورة في الحقل الساطع لتسجيل الخطوط العريضة لجسم الخلية.
ثم يتم إيقاف تشغيل إضاءة المجال الساطع ويتم تمكين كسب الكاميرا إلى أقصى حد للتصوير باستخدام تألق الانعكاس الداخلي الكلي ، المعروف أيضا باسم العشب. ابدأ في الحصول على الكاميرا وافتح غالق الليزر لإثارة البروتينات الفلورية داخل البكتيريا. يجب تحسين معلمات شدة الليزر وسرعة الاستحواذ للنظام البيولوجي المعين.
تضيء العينات قيد الدراسة حتى يتم تبييض الصورة ، والتي تستغرق عادة حوالي 10 ثوان. بمجرد جمع البيانات ، يتم إدخال الصور في برنامج تحليل مكتوب مخصص ، والذي يكتشف تلقائيا مواضع بقع الفلورسنت في الخلايا بدقة بضعة نانومترات ويستخرج حجمها وسطوعها. ثم يتم استخدام سطوع أثر التبييض الضوئي فيما يتعلق بوقت جذب المركب الجزيئي لتقدير استخدام القياس المتكافئ.
باستخدام هذه الطريقة ، تكون صورة الخلايا التي يتم عرضها في المجال الساطع مميزة للغاية ، بحيث تكون محيط أجسام الخلية مظلمة مقابل جسم خلية رمادية بيضاء باستخدام التألق مع الخلايا المجمدة. يمكن رؤية بقع مميزة من الشدة التي يتراوح عرضها عادة من 250 إلى 300 نانومتر معروضة هنا بألوان زائفة. يمكن رؤية الخلايا المربوطة السليمة وهي تدور حول نقطة ربط الحبل في صور المجال الساطع تحت إثارة الفلورسنت.
يمكن أيضا رؤية بعض المجمعات الجزيئية عند نقطة التعلق مما يشير إلى توطين البروتين المخزن بمحرك جيلر. هذه البقع هي مجمعات جزيئية فردية. يعتمد عدد هذه الأشياء التي يتم رؤيتها على وضع الإضاءة المستخدم وعدد المجمعات الموجودة بالفعل في الخلية في أي وقت.
إذا كانت كثافة البقع عالية جدا في البداية ، كما هو الحال مع السيتوكرومات المسماة المستخدمة هنا ، فإن إجراء مبيض فراب أولي يمكن أن يحسن تباين التصوير. تعتمد حركة البقع على النظام البيولوجي المحدد. قيد الدراسة ، أوضحنا لك للتو كيفية تصور المجمعات الجزيئية المفردة باستخدام الفحص المجهري الفلوري المتقدم.
عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم عدم وجود خلايا قص لأن هذا قد يضعف وظائف محرك العلم. من المهم أيضا عدم ترك الخلايا على شرائح المجهر لأكثر من ساعة حيث قد تنضب الأكسجين. الأتمتة مطلوبة للعثور على أفضل ظروف التصوير.
يمكن أن يساعد في استخدام GFP المنقى وحده للتأكد من طاقة الليزر الصحيحة لنظام المجهر الخاص بك. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
توضح هذه المقالة بروتوكولات لتصوير الفلوريسنس لجزيء واحد على الخلايا البكتيرية الحية. تمكن الطريقة من كشف، وتتبع، وتقدير المجمعات الجزيئية الوظيفية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- مجهر الفلوريسنس
- بيولوجيا الخلية
- التصوير الجزيئي
الخلفية
- يتيح مجهر الفلوريسنس لجزيء واحد مراقبة الجزيئات الفردية في الخلايا الحية.
- تعتبر هذه التقنية ضرورية لدراسة العمليات الديناميكية في البيئات الخلوية.
- يعتبر فهم المجمعات الجزيئية ضروريًا للحصول على رؤى حول وظائف الخلايا.
- تعتبر الخلايا البكتيرية الحية نظامًا نموذجيًا لهذه الدراسات.
غرض الدراسة
- لتوفير بروتوكول مفصل لإجراء تصوير الفلوريسنس لجزيء واحد.
- لتمكين الباحثين من تصور وتقدير المجمعات الجزيئية في الخلايا الحية.
- لتعزيز فهم التفاعلات الجزيئية في الخلايا البكتيرية.
الطرق المستخدمة
- زراعة البكتيريا التي تعبر عن بروتين مرتبط بصبغة فلوريسنس.
- استخراج الخلايا وقص خيوط السوط عن طريق القص.
- تغطية شريحة زجاجية في خلية تدفق لتسهيل التصاق الخلايا.
- حقن الخلايا في خلية التدفق واستخدام مجهر التحريض بالليزر للتصوير.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للمجمعات الجزيئية الموسومة في الخلايا البكتيرية الحية.
- تقدير التفاعلات الجزيئية من خلال التصوير الفلوريسنسي.
- تبيان فعالية البروتوكول في سياق الخلايا الحية.
- توفير طريقة قابلة للتكرار للباحثين في المجال.
الاستنتاجات
- يمكن البروتوكول من إجراء دراسات مفصلة للمجمعات الجزيئية في الخلايا الحية.
- يعتبر مجهر الفلوريسنس لجزيء واحد أداة قوية لبيولوجيا الخلية.
- يمكن تعديل هذه الطريقة لمختلف التطبيقات في التصوير الجزيئي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Visualizing single molecular complexes in living bacterial cells enables mechanistic de-risking of target validation by revealing stochastic and heterogeneous dynamics masked in ensemble measurements. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing physiologically relevant, minimally perturbative observations of functional biological machines at near-native expression levels. The method enhances translational continuity from discovery through preclinical stages by delivering quantitative, reproducible data on molecular interactions in functional contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of single-molecule stoichiometry and dynamics in functional complexes.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of molecular interactions under near-native conditions, reducing reliance on overexpression artifacts.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment by revealing heterogeneity and functional states invisible to bulk assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-precision spatial and temporal data on molecular complexes for assay benchmarking and validation.
- Operational Value: Delivers reproducible fluorescence-based outputs detectable via standard microscopy platforms.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization through quantifiable single-molecule brightness and bleaching kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining physiological relevance through genomic encoding of fluorescent tags.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of complex dynamics in live cells to inform mechanism-of-action studies.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular complex behavior with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing single-molecule resolution of target engagement and complex assembly, informing lead identification through mechanistic insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of molecular complex formation and disassembly in live cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of tethered or immobilized cells with quantifiable fluorescent spot detection.
- Analytics: Delivers nanometer-scale positional data and brightness trajectories for stoichiometry estimation and complex size quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving native expression levels and minimizing cellular perturbation during imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for multiple targets through adaptable fluorescent tagging and flow cell preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct observation of stochastic molecular behavior in functional contexts.
- Operational Value: Standardization via reproducible cell preparation, flow cell assembly, and image acquisition parameters.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative single-molecule dynamics data.
Implementation Considerations
- Expertise in fluorescence microscopy, bacterial culture, and protein tagging.
- Instrumentation including high numerical aperture objectives, laser excitation, and cooled EMCCD cameras.
- Cross-team standardization of shearing protocols, flow cell preparation, and image analysis pipelines.
- Adaptation considerations for different bacterial strains, fluorescent tags, and target complexes.
- Practical limitations include photobleaching constraints and shear sensitivity of flagellar function.
