إعداد مقسمة ميكروتثبول لدراسة الاقتراحات وانطلاقا من تفكيك أنيبيب ينتهي

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة حركات جزيئات البروتين والخرز المطلي بالبروتين مع نهايات إزالة البلمرة من الأنابيب الدقيقة. يتم تحقيق ذلك من خلال تجميع غرفة تدفق قابلة لإعادة الاستخدام مع زلة غطاء نظيفة الحجم. بعد ذلك ، يتم تحضير بذور الأنابيب الدقيقة المرفقة بزلة الغطاء واستخدامها في نواة الأنابيب الدقيقة ، والتي يتم تثبيتها مؤقتا باستخدام أغطية قابلة للتدمير بالصورة.

ثم يتم إدخال البروتينات المسماة GFP أو الخرز المطلي بالبروتين إلى غرفة التدفق وترتبط بالأنابيب الدقيقة المجزأة. ثم يتم تشغيل إزالة بلمرة الحوض الصغير عن طريق إزالة الأغطية عن طريق الاستئصال الضوئي. يتم تحليل الصور باستخدام CH لتحديد ما إذا كانت البروتينات المصنفة تظهر سلوك تتبع الأطراف ، وهو الحركة مع نهايات إزالة البلمرة من الأنابيب الدقيقة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتشغيل الأنابيب الدقيقة بدقة زمنية عالية وخاصة. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. يبدأ البروتوكول بإعداد غرفة التدفق وتجميعها باستخدام الطحن بالموجات فوق الصوتية.

قم بتعديل شرائح المجهر العادية لتحتوي على أخاديد. اجعل الأخاديد على بعد 14 ملم. أعط أو خذ ملليمترا واحدا ، وهو مثالي للغرف المجمعة باستخدام زلات غطاء مربعة مقاس 22 ملم.

بعد ذلك ، ضع أنبوب بولي إيثيلين بطول 100 ملم في كل أخدود في الشريحة ، مع ترك حوالي خمسة ملليمترات متدلية في الأطراف الداخلية للأخاديد. قم بتثبيت الأنابيب داخل الأخاديد باستخدام غراء cyanoacrylate ، وقم بتضمين الأنابيب بالكامل داخل الأخاديد. املأ الأخاديد بعناية بغراء الايبوكسي دون انسكاب.

اتركه ليجف ليوم واحد. في اليوم التالي. استخدم شفرة حلاقة حادة لقطع الغراء المتصلب ، من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات من الطرف البعيد لكل موقع ملحق.

إزالة الأجزاء القريبة من وسط الشريحة. يجب أن تبقى الأنابيب في أخاديدها ويجب أن تصنع القطع أسطحا مستوية بفتحات أنبوب. بعد ذلك ، املأ حقنة بالماء واختبر ما إذا كانت الأنابيب تعمل بشكل صحيح.

إذا كان السائل يتدفق بحرية ، ضع قطرة من غراء الإيبوكسي يبلغ قطرها حوالي خمسة ملليمترات في الأطراف الخارجية للأخاديد واتركها تجف لمدة يوم تقريبا. وبالتالي فإن غرف التدفق المكتملة متينة ويمكن استخدامها بشكل متكرر لعدة أشهر. يعد هذا البروتوكول الذي مدته ثلاث ساعات 12 قسيمة غطاء.

يتطلب غطاء دخان ، وحامل انزلاق غطاء سيراميك واحد ، وثلاثة 15 مليلتر ، وبرطمانات تلطيخ ، و 1 250 مليلتر من الجرار الزجاجي بغطاء. يجب أن تتسع برطمانات التلوين لأربعة زلات غطاء رقم 1 22 ملم في كومة. ابدأ بكومة من 12 غطاء نظيفا ومجففا مسبقا في حامل السيراميك.

املأ البرطمان بمحلول سيلين واحد بالإضافة إلى واحد وقم بخفض الشرائح ببطء. أغلق البرطمان واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تتمثل الخطوة الأكثر أهمية لضمان حضارة انزلاق الغطاء الموحد في تجنب أي آثار مائية أثناء حضانة زلات الغطاء في محلول سيلين.

هذه الخطوة ضرورية للربط المحكم ببذور البوق الدقيقة. في وقت لاحق في بروتوكول ، عندما يكون الغطاء جاهزا ، قم بإزالة حامل السيراميك من الجرة. ثم انقل زلات الغطاء بشكل فردي باستخدام ملاقط مطلية بالتفلون من حامل السيراميك إلى برطمانات تلطيخ محملة بالميثانول.

الآن قم بتحميل الجرار الثلاثة في خزان المياه لحمام صوتي مع قاعدة معدنية أو زجاجية فيه. يجب أن يكون مستوى الماء عند ثلثي ارتفاع الجرار ، ويقوم بصوتنة الجرار عند 70 واط لمدة 20 دقيقة. أثناء الصوتنة ، قم بتغيير محلول الميثانول كل خمس دقائق.

عند اكتمال الصوتنة ، شطف ، ينزلق الغطاء نظيفا 10 مرات بالماء منزوع الأيونات. إذا عملت العزلة بشكل صحيح ، فستظهر زلات الغطاء جافة عند إزالتها من الماء ، بغض النظر عن المظهر ، قم بإزالة أي مياه متبقية تماما. باستخدام نقل غاز النيتروجين ، ينزلق الغطاء المجفف إلى حاوية قابلة للغلق بالنيتروجين.

مناديل Kim المبللة بين زلات الغطاء. يمكن تخزينها بهذه الطريقة لعدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة. يتطلب هذا البروتوكول من ساعة إلى ساعتين ، وغرفة تدفق واحدة وبذور أنبوبية دقيقة مستقرة من G-M-P-C-P-P.

أولا ، قم بتجميع غرفة التدفق. قم بإرفاق قطعتين من الشريط على الوجهين على طول المنطقة المركزية التي يبلغ عرضها خمسة ملليمترات من الشريحة المعدة ، واضغط بقوة على زلة الغطاء على الشريط. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد ، املأ الغرفة ب 100 ميكرولتر من محلول B rrb 80 عبر أنبوب.

بعد ذلك ، اضغط على قطرة صغيرة من اثنين من المواد المانعة للتسرب سريعة الصب الملونة فوق طبق بتري بلاستيكي صغير. امزجها بسرعة وبشكل جيد باستخدام عود أسنان. سوف يتحول إلى اللون الأخضر.

ضع المادة المانعة للتسرب على الفور على طول جميع حواف زلة الغطاء. تحقق مما إذا كان مانع التسرب يخترق بعمق شديد تحت زلة الغطاء. إذا كان الأنبوب مسدودا ، فافصل المحقنة وارفع الأنبوب لتطبيق ضغط لطيف لمنع تسرب المادة المانعة للتسرب بعد 10 دقائق ، تأكد من عدم تقييد تدفق المحلول.

ثم انقل الغرفة إلى مرحلة مجهر دافئ عند 32 درجة مئوية. قم بتوصيل أحد الأنابيب بمضخة لإزالة المحلول. اغمر الطرف الحر لأنبوب المدخل في قارورة 0.5 ملم مع عازلة BRB 80 دافئة.

اضبط المضخة على 100 ميكرولتر في الدقيقة وحسب الحاجة ، استخدمها لدفع فقاعات الهواء برفق. يمكن أيضا القيام بذلك يدويا. استخدم الآن المضخة لتحميل 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة للمستضد الدافئ.

قم بإيقاف تشغيل المضخة وانتظر خمس دقائق. قم بإيقاف تشغيل المضخة أثناء جميع الحضانات. بعد ذلك ، اغسل الغرف بحوالي 100 ميكرولتر من الدافئ b rrb 80.

ثم قم ببث 50 ميكرولتر من 1٪ Onic F1 27 في BRB 80. انتظر 10 دقائق حتى يسد السطح الكارهة للماء لزلة الغطاء المنعزلة. الآن اغسل الغرف ب 100 ميكرولتر من عازلة الحركة.

بعد ذلك ، قلل سرعة المضخة إلى 15 ميكرولتر في الدقيقة وقم ببث الغرفة ب 30 إلى 40 ميكرولترا من بذور الأنابيب الدقيقة المخففة من واحد إلى 200 إلى واحد إلى 600 في المخزن المؤقت للحركة. احتضن البذور لمدة 15 دقيقة ، ثم اغسل الغرفة ب 400 ميكرولتر من عازلة الحركة بسرعة 100 ميكرولتر في الدقيقة لإزالة أي مادة غير مرتبطة. بعد ذلك ، قلل سرعة المضخة إلى 30 ميكرولتر في الدقيقة وقم ببث الغرفة بمحلول توبولين غير مسمى التسخين.

تتمثل الجوانب الأكثر أهمية في هذا البروتوكول في تجنب فقاعات الهواء. لاستخدام محاليل التوبولين المعدة حديثا واتباع التوقيت الدقيق للبروتوكول ، خاصة أثناء الغطاء الأنبوبي الدقيق. مراقبة نمو الأنبوب الدقيق باستخدام بصريات DIC خلال فترة الحضانة من خمس إلى سبع دقائق.

عادة ما تنمو الأنابيب الدقيقة حوالي 10 ميكرون ، وتتبادل المحلول بسرعة مع مزيج Rumine Tubulin قبل الحرب وتسمح بوقت حضانة إضافي من ثماني إلى 10 دقائق. اغسل الغرفة جيدا ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحركة بسرعة 20 ميكرولتر في الدقيقة لإزالة الاضطرابات والنيوكليوتيدات ، وكذلك شظايا الأنابيب الدقيقة القابلة للذوبان. بعد ذلك ، قم بدمج الغرفة بمحلول دافئ من الخرز المطلي بالبروتين أو البروتين المسمى GFP والمضي قدما في تصوير مكون حركية الخميرة DAM الذي تم تنقية DAM المسمى ب GFP من الخلايا البكتيرية واستخدامه كعنصر تحكم إيجابي لمقايسات تتبع الأطراف.

تتعقب هذه البروتينات مع نهاية إزالة البلمرة للأنبوب الدقيق وتتحرك بثبات نحو البذور المرفقة بزلة الغطاء. تظهر هذه البروتينات كخط مائل على رسم بياني مقابل ، والذي يمكن تحليله بعد ذلك لتحديد عدد جزيئات البروتين في مجمع تتبع الأطراف. هذا التحليل مفصل في بروتوكول النص.

في المقابل ، لا تظهر البروتينات التي تفشل في قلب المسار تخصيبا في إشارة التألق في الطرف الجزئي القابل للتفكيك. يظهر هذا مع بروتين NDC 80 GFP البشري. عادة ما يكون الارتباط بين الخرز المطلي بالبروتين والأنابيب الدقيقة قويا جدا ، لذلك عندما تمت إضافة الخرزات إلى غرفة الفحص المجهري ، فإنها ترتبط بسهولة بالأنابيب الدقيقة المرفقة بالغطاء المجزأ.

عندما يكون تتبع الخرزة عمليا ، يمكن إجراء العديد من الملاحظات. أظهرت الخرزات التي ترتبط بأنبوب دقيق واحد حركة تشبه القوس حيث تدور الأنابيب الدقيقة قليلا حول موقع نموها. عندما يضيء غطاء التثبيت ، إذا كان من الممكن رؤية جزء أحمر واحد فقط بعيدا عن البذرة والخرزة ، توصيل الخرزة بأنبوب دقيق واحد.

غالبا ما يمكن رؤية الغطاء يتبع حركة الخرزات على حد سواء حتى يتم تبييض الغطاء تبدو حركة الخرزة بعد فترة وجيزة من التبييض متوافقة مع اتجاه الأنابيب الدقيقة. مع تقصير الأنبوب الصغير وتحرك الخرزة نحو البذرة ، ينخفض اتساع القوس مثل التذبذبات. إذا فشلت الخرزات في تكوين مرفقات دائمة بالأنابيب الدقيقة المستقرة.

يمكن استخدام الاصطياد بالليزر ، والخرز مع تركيبات بروتينية مختلفة من كينيسين موجه إلى طرف زائد ، تطلب SE E هذه التقنية لإطلاق الخرزات على الجدران الأنبوبية الدقيقة المجزأة في وجود TP. تحركت هذه الخرزات بسرعة نحو نهايات الجمع الأنبوبي الصغير المغطى على الرسم البياني. نتج عن هذه الحركة خط مائل موجه نحو الغطاء بعد تدمير الغطاء. الخرزات المغلفة ببروتين تجسس مقطوع منفصلة عن النبيبات الدقيقة كما هو موضح في السهم الأخضر.

في المقابل ، يمكن للخرز الذي يحتوي على بروتين B كامل الطول أن يحافظ على الحركة في الاتجاه العكسي. ينظر إلى هذا على أنه نمط متعرج على الرسم البياني chm بسبب الحركة في اتجاهات متعارضة إما لنهاية زائد أو ناقص الأنابيب الدقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير غرف التدفق وزراعة الأنابيب الدقيقة المجزأة لدراسة الحركات التي يقودها تفكيك البوق الدقيقة.