فرز المتسلسلة الكريات الخلية باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز

الهدف العام من هذا الإجراء هو فرز الكريات الفطرية التي تتكون من العقديات الخيطية وفقا للحجم ، باستخدام مقياس التدفق الخلوي COPA للجسيمات الكبيرة. يتم تحقيق ذلك أولا من خلال النمو وأخذ العينات اللاحقة للسلالة البكتيرية المرغوبة. في الخطوة الثانية ، يتم قياس سلالة العينة بواسطة coppa.

ثم يتم تحليل البيانات في السيليكو ويتم فرز الكريات الفطرية وفقا للمعلمات التي يحددها المستخدم. في النهاية ، يمكن استخدام هذه التحليلات لتوصيف عدم تجانس حجم الحبيبات بشكل أكبر. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة في Streptomyces ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الأخرى مثل الفطريات الخيطية ، مما يدل على أن هذا الإجراء سيكون MaRous Petrus ، طالب دكتوراه من مختبرنا.

أولا ، قم بتنمية الثقافات عن طريق إضافة 100 مل من مستخلص الخميرة ، ووسط مستخلص الشعير و 0.2 مل من 2.5 مولار كلوريد المغنيسيوم إلى قارورة واحدة معقمة سعة 250 مليلتر من إرلينماير ، ومجهزة بنوابض معدنية ملفوفة لكل عينة بكتيرية. ثم قم بتلقيح كل قارورة ب 1 في 10 إلى ثمانية جراثيم من Streptomyces للحصول على تركيز بوغ واحد في 10 إلى ستة جراثيم لكل مليلتر وتنمو البكتيريا عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة. بعد يومين ، استخدم ماصة معقمة سعة خمسة ملليلتر لجمع عينة من خمسة ملليلتر من كل مزرعة مع هز القارورة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي.

ثم استغن عن كل عينة في أنابيب مخروطية فردية سعة 15 مل. لتقييم العينات عن طريق تحليل copus ، تأكد من تشغيل كمبيوتر copus plus pump وليزر الأرجون 488 نانومتر ، ثم افتح برنامج المصدر الحيوي. تأكد من أن زجاجة سائل الغمد ممتلئة وأن زجاجة النفايات فارغة، ثم انقر فوق البدء والتشغيل.

لتبديل ليزر الأرجون 488 نانومتر من وضع الاستعداد إلى التشغيل بعد حوالي 60 ثانية ، سيكون الليزر جاهزا. انقر ، قم ، ثم تحقق من مقاييس الضغط. انقر فوق مربع الاختيار بجوار الضغط.

حسنا ، وبعد أن يقوم النظام بتجهيز خلية التدفق ، تأكد من أن إعداد التأخير عند 11 وأن العرض عند سبعة. اضبط العتبات على 50 للإشارة و 40 لوقت الرحلة كحد أدنى. ثم قم بإزالة الماء المتبقي من كوب العينة.

أضف حوالي 50 مل من PBS ، ثم أضف 0.1 ملليلتر من إحدى عينات البكتيريا العقدية إلى الكوب. تأكد من إغلاق الكوب بشكل صحيح ثم انقر فوق الحصول لبدء جمع البيانات. قم بإدارة سرعة التدفق للحصول على ما بين 30 و50 حدثا في الثانية عند تجميع 2,500 حدث على الأقل.

انقر وتوقف ثم قم بتخزينها لحفظ البيانات للتحليل الإحصائي اللاحق لفرز الكريات البكتيرية لكل عينة. قم أولا بتعيين حدود الفرز وأدخل تفاصيل حول الحد الأدنى والحد الأقصى لوقت قيم الرحلة. بدلا من ذلك ، حدد المناطق ثم حدد منطقة البوابة لإنشاء منطقة لتحديد الكريات بالأبعاد والخصائص المطلوبة.

ضع أنبوبا سعة 50 ملليلتر لجمع الكريات التي تفي بمعلمات الفرز. ثم اضبط عدد الكريات المراد فرزها وانقر فوق الفرز يدويا لفرز المعلمات المحددة. بعد الفرز ، قم بإزالة العينة المتبقية واشطف كوب العينة بالماء مرتين.

قبل إغلاق الكوب ، قم بتنظيف كوب العينة بنسبة 70٪ من الإيثانول. الآن قم بتشغيل النظام مرتين. مرة واحدة بالماء المكلور ومرة بالماء العادي ، ثم أفرغ حاوية الفائض بعد التنظيف ، انقر فوق إيقاف لتحرير الضغط من النظام.

عندما يتوقف المحرك ، أغلق البرنامج وانقر فوق إيقاف التشغيل دون تطهير. ثم قم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر ، والكوبا ، والليزر ، وشكل المضخة العقدية. الكريات الفطرية والثقافات السائلة التي لها مجموعة واسعة من الأحجام.

لتحليل توزيع حجم الحبيبات ، خضعت ثقافة ألوان streptomyces cila المزروعة بالسائل البالغ من العمر يومين لقياس تدفق الجسيمات الكبير باستخدام ملف تعريف copus plus المجهز بفوهة ملليمتر واحد. هنا ، يتم عرض مخطط مبعثر نموذجي لإخراج copus. يمثل المحور x وقت الرحلة.

كلما كان الاستئناف الأكبر هو المدة التي يستغرقها تمرير شعاع الليزر. يشير المحور Y إلى الانقراض ، والذي يمثل الكثافة البصرية للجسم ، كل نقطة في النقطة تتوافق مع حبيبات واحدة تمر عبر شعاع الليزر. أشار رسم نقاط البيانات في رسم بياني إلى أن الأحجام من هذه العينة التمثيلية لم يتم توزيعها بشكل طبيعي.

يبدو أن التوزيع كان منحرفا إلى السجل الصحيح. كما أن تحويل مجموعة البيانات لم يؤد إلى توزيع طبيعي لتقييم ما إذا كان يمكن تفسير توزيع الحجم بافتراض مزيج من توزيعين عاديين ، فقد تم نمذجة البيانات رياضيا. أشارت النمذجة بالفعل إلى وجود مجموعة من الكريات الصغيرة تتكون من 92٪ من جميع الكريات بمتوسط حجم 248 ميكرومتر ، ومجموعة من الكريات الكبيرة تشكل 8٪ من جميع الكريات بمتوسط حجم 319 ميكرومتر.

هنا يتم عرض تحليل تمثيلي للمستعمرات الصغيرة التي تم فرزها من مجموعات الحبيبات الكبيرة والصغيرة. تم استخدام متوسط أحجام الحبيبات للمجموعتين لتحديد حدود الفرز للحد من فرز الكريات من الجزء المتداخل من توزيعي الحجم ، واعتبرت الكريات الأصغر من 248 ميكرومتر من مجموعة الحبيبات الصغيرة ، بينما اعتبرت الكريات الأكبر من 319 ميكرومتر من مجموعة الحبيبات الكبيرة. أكد التحليل المجهري للكريات التي تم فرزها أحجامها المميزة بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي أو البروتينات لكشف الآليات الأساسية لهذا عدم التجانس.