فرز

الهدف العام من هذا الإجراء هو فرز كريات الغزل الفطري التي تشكلها بكتيريا streptomyces الخيطية وفقاً للحجم، وذلك باستخدام مقياس تدفق خلوي COPA للجزيئات الكبيرة. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تنمية السلالة البكتيرية المطلوبة ثم أخذ عينات منها. وفي الخطوة الثانية، يتم قياس السلالة المأخوذة من العينة بواسطة coppa.

يتم بعد ذلك تحليل البيانات حاسوبياً (in silico) وفرز كريات الميسيليوم وفقاً للمعايير التي يحددها المستخدم. وفي النهاية، يمكن استخدام هذه التحليلات لمزيد من التوصيف لعدم تجانس حجم الكريات. وبالرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة مع بكتيريا streptomyces، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات أخرى مثل الفطريات الخيطية، وسيقوم MaRous Petrus، طالب الدكتوراه من مختبرنا، باستعراض هذا الإجراء.

أولاً، يتم تنمية المزارع بإضافة 100 milliliters من وسط مستخلص الخميرة ومستخلص المالت و 0.2 milliliters من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 2.5 molar إلى دورق إرلنماير معقم سعة 250 milliliter، مزود بنوابض لولبية معدنية لكل عينة بكتيرية. ثم يتم تلقيح كل دورق بـ 1×10⁸ من أبواغ streptomyces للحصول على تركيز أبواغ يبلغ 1×10⁶ بوغ لكل milliliter، وتُنمى البكتيريا عند 30 °C مع الرج بسرعة 180 RPM. وبعد مرور يومين، تُستخدم ماصة معقمة سعة 5 milliliters لجمع عينة بحجم 5 milliliters من كل مزرعة مع رج الدورق برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي.

بعد ذلك، يتم توزيع كل عينة في أنابيب مخروطية فردية سعة 15 milliliter. ولتقييم العينات عن طريق تحليل copus، تأكد من تشغيل كمبيوتر copus plus pump وليزر الأرجون بطول موجي 488 nanometer، ثم افتح برنامج bio source. تأكد من أن زجاجة سائل الغلاف ممتلئة وأن زجاجة النفايات فارغة، ثم انقر فوق start و run.

لتحويل ليزر الأرجون بطول موجي 488 nanometer من وضع الاستعداد إلى وضع التشغيل، انتظر حوالي 60 ثانية حتى يصبح الليزر جاهزاً. انقر فوق "تم"، ثم تحقق من مقاييس الضغط. حدد مربع الاختيار المجاور لكلمة الضغط.

حسناً، وبعد أن يقوم النظام بتهيئة خلية التدفق، تأكد من أن إعداد التأخير هو 11 وأن العرض هو 7. اضبط عتبات القياس عند 50 للإشارة و40 كحد أدنى لزمن الطيران. ثم قم بإزالة الماء المتبقي من كوب العينة.

أضف حوالي 50 milliliters من PBS، ثم أضف 0.1 milliliter من إحدى عينات strep demy إلى الكوب. تأكد من إغلاق الكوب بإحكام، ثم انقر على acquire لبدء جمع البيانات. اضبط سرعة التدفق للحصول على ما بين 30 و50 حدثاً في الثانية الواحدة عند جمع 2,500 حدث على الأقل.

انقر فوق "إيقاف" (stop)، ثم "تخزين" (store) لحفظ البيانات من أجل التحليل الإحصائي اللاحق لفرز الكريات البكتيرية لكل عينة. أولاً، قم بتعيين حدود الفرز وأدخل التفاصيل المتعلقة بالقيم الدنيا والقصوى لزمن الطيران (time of flight). بدلاً من ذلك، اختر المناطق ثم حدد منطقة البوابة (gate region) لإنشاء مساحة لاختيار الكريات ذات الأبعاد والخصائص المطلوبة.

ضع أنبوباً بسعة 50 milliliter لجمع الكريات التي تستوفي معايير الفرز. بعد ذلك، حدد عدد الكريات المراد فرزها وانقر على "sort manually" للفرز وفقاً للمعايير المختارة. بعد انتهاء عملية الفرز، قم بإزالة العينة المتبقية واشطف كوب العينة بالماء مرتين.

قبل إغلاق الجهاز، قم بتنظيف كوب العينة باستخدام 70%ethanol. الآن، قم بتشغيل النظام مرتين؛ مرة باستخدام مياه مكلورة ومرة أخرى باستخدام مياه عادية، ثم قم بتفريغ حاوية التصريف. بعد التنظيف، انقر فوق إيقاف (stop) لتحرير الضغط من النظام.

عندما يتوقف المحرك، أغلق البرنامج وانقر على إيقاف التشغيل دون التطهير. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر، وجهاز copa، والليزر، والمضخة. حبيبات الميسليوم والمزارع السائلة التي تتفاوت أحجامها بشكل كبير.

لتحليل توزيع حجم الحبيبات، خضعت مزرعة سائلة من *Streptomyces cila color* عمرها يومان لتحليل قياس التدفق الخلوي للجزيئات الكبيرة باستخدام جهاز Copus Plus Profiler مجهز بفوهة قياسها 1 مليمتر. يظهر هنا مخطط تشتت نموذجي لمخرجات جهاز Copus، حيث يمثل المحور السيني زمن الطيران.

كلما زاد حجم الكريّة، استغرق مرورها عبر شعاع الليزر وقتاً أطول. يشير المحور Y إلى التوهين، والذي يمثل الكثافة الضوئية للجسم، حيث تتوافق كل نقطة مع كريّة واحدة تمر عبر شعاع الليزر. وقد أظهر تمثيل نقاط البيانات في مخطط مدرج تكراري أن الأحجام في هذه العينة الممثلة لم تكن موزعة توزيعاً طبيعياً.

بدا أن التوزيع ملتويًا جهة اليمين لوغاريتميًا. كما أن تحويل مجموعة البيانات لم يؤدِّ إلى توزيع طبيعي، ولتقييم ما إذا كان يمكن تفسير توزيع الحجم بافتراض وجود خليط من توزيعين طبيعيين، تم إجراء نمذجة رياضية للبيانات. وبالفعل، أشارت النمذجة إلى وجود مجموعة من الحبيبات الصغيرة تشكل 92% من إجمالي الحبيبات بمتوسط حجم قدره 248 micrometers، ومجموعة من الحبيبات الكبيرة تشكل 8% من إجمالي الحبيبات بمتوسط حجم قدره 319 micrometers.

يظهر هنا تحليل ممثل للمستعمرات الدقيقة التي تم فرزها من مجموعات الكريات الكبيرة والصغيرة. وقد استُخدم متوسط أحجام الكريات في المجموعتين لتحديد حدود الفرز، وذلك للحد من فرز الكريات من الجزء المتداخل في توزيعي الحجمين؛ حيث اعتُبرت الكريات التي يقل حجمها عن 248 micrometers من مجموعة الكريات الصغيرة، بينما اعتُبرت الكريات التي يزيد حجمها عن 319 micrometers من مجموعة الكريات الكبيرة. وقد أكد التحليل المجهري للكريات المفروزة تمايز أحجامها بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الجيل القادم أو البروتوميات للكشف عن الآليات الكامنة وراء هذا التباين.