خطوة محددة الفرز ماوس Spermatids بواسطة التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل المنوية في الفئران إلى أربع مجموعات متميزة ، مما يسمح بالدراسة الجزيئية لتكوين المنوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكاثر المرآة ، مثل تأثير النمذجة اللونية على السلامة الجينومية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر فصل المنوية إلى خلايا نقية دون تلوث متبادل.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا اختلافات مهمة في شدة تلطيخ DN أثناء إعادة تشكيل الكروماتين في معلمات haplo في اليوم السابق لفرز الخلايا. أضف ملليلترا إلى ملليلترين من FBS المعطلة بالحرارة إلى قاع دائري من مادة البولي بروبيلين سعة خمسة ملليلتر ، وأنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلين سعة 15 و 50 ملليلترا. بعد ذلك ، قم بتغطية الأنابيب ببطء عن طريق الانعكاس طوال الليل عند أربع درجات مئوية على دوار في اليوم التالي.

صب FBS بعناية باستخدام ماصة P 200 لإزالة أي بقايا FBS من الأنابيب 15 و 50 مليلتر وترك حجم صغير متبقي من 100 إلى 200 ميكرولتر من FBS في أنابيب سعة خمسة ملليلتر لجمع الخلايا المنقاة في يوم الخلية. الفرز ، فرم قطع الاختبار المغلفة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز. ثم انقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر باستخدام طرف ماصة دقيقة مقطوعة.

اغسل الخلايا الجرثومية من الأنابيب المنوية باستخدام ماصة لطيفة لأعلى ولأسفل ، متبوعة بالتنظيف بطرف سليم. بعد ذلك ، استخدم مصفاة خلية 40 ميكرون لإزالة الحطام والكتل التي تجمع المرشح في أنبوب مخروطي مطلي ب FBS سعة 50 مل. اغسل الفلتر مرة واحدة باستخدام مخزن فرز يصل حجمه الإجمالي إلى ثلاثة ملليلتر وانقل المرشح إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 ملليلتر مطلي بالFBS.

ثم أضف 16 ميكرولترا من EDTA لكل مليلتر من تعليق الخلية إلى الخلايا واستخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لإصلاح الخلايا ببطء على مدى دقيقة واحدة بثلاثة أحجام من المثلج البارد ، 100٪ الإيثانول أثناء الدوامة منخفضة السرعة ، سيصبح التعليق حليبي بعد التثبيت. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة مع انعكاس عرضي. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ، وأعد تعليق البليت في ملليلترين من عازلة الفرز وصمة عار الخلايا الجرثومية بأربعة ميكرولترات من cyto 16 DNAD مباشرة قبل الفرز.

قم بتصفية الخلايا من خلال مرشح 50 ميكرون في أنبوب فاكس مطلي ب FBS واغسل الفلتر على نطاق واسع باستخدام واحد إلى ملليلتر من مخزن الفرز. قم بتحميل الخلايا الجرثومية الثابتة على فارز خلايا مجهز بالليزر 488 نانومتر. بعد ذلك ، اعرض إجمالي الأحداث باستخدام رسم بياني يمثل عدد الأحداث ضد منطقة الطابق 4 88 من Alexa وقم ببوابة خلايا تلطيخ الحمض النووي الإيجابية.

ثم اعرض الخلايا من هذه البوابة في منطقة مبعثر جانبية مقابل مخطط منطقة مبعثر أمامية وبوابة. تعرض الخلايا كما هو موضح هذه الخلايا المسورة في منطقة مبعثرة أمامية مقابل منطقة أرضية Alexa 4 88 ، وقطعة أرض وبوابة. ثم تعرض الخلايا هذه البوابات مرة أخرى في طابق Alexa منفصل 4 88 بعرض مقابل Alexa floor 4 88 قطع أراضي.

يتكون تكوين المنوية من واحد إلى تسعة ومن 10 إلى 12. يمكن بعد ذلك ربط المنوية بالفرز لجمع الخطوات من 13 إلى 14 ومن 15 إلى 16. تعرض المنوية الخلايا من البوابة الأولى إلى منطقة تشتت أمامية مقابل مخطط وبوابة منطقة EXOR 4 88.

مجموعات الخلايا كما هو موضح. ثم اعرض هذه البوابات في Alexa الفردية. الطابق 4 88 العرض مقابل الطابق Alexa 4 88 قطعة أرض وبوابة.

الخطوات من 13 إلى 14 ومن 15 إلى 16 منويا للفرز. أخيرا ، اجمع الكسور المنقاة في 100 إلى 200 ميكرولتر من FBS في FBS الفردية المغلفة بخمسة مليلتر من أنابيب القاع المستديرة على الجليد. في هذه الصور يظهر تلطيخ باهت للتدفق المصنف من المجموعات المضربة.

ما تعرض درجات تكوين المنوية من واحد إلى تسعة منوية نوى مستديرة الشكل تبدو بيضاوية الشكل في تكوين النطاف. الخطوة التاسعة المنوية ، والتي يتم ملاحظتها على أنها خطافات ممدودة في الخطوات من 10 إلى 12. تظهر النطاف المنوية من 13 إلى 14 ومن 15 إلى 16 منوية نوى ذات شكل مماثل ، ولكن مع كثافة تلطيخ الحمض النووي المختلفة قليلا ، مما يسمح بتحديد هذه المجموعات المتميزة أثناء فرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

باتباع البروتوكول المثبت ، يمكن توقع أن يتراوح نقاء مجموعات S الفردية التي تم تجربتها بين 95 و 100٪ يمكن إكمال هذه التقنية في ست إلى ثماني ساعات. إذا تم اتباع كل خطوة بشكل صحيح. يجب أن تتذكر دائما إبقاء الخلايا على الجليد طوال الإجراء باتباع هذا الإجراء للحصول على مجموعات متميزة من المنوية ، مما يوفر كمية كافية من المواد للتحليل الجزيئي ، مثل توصيف عملية إعادة تشكيل تينغ الدراماتيكية أو لدراسة التأثير الجيني لهذا الانتقال.