متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

الهدف العام لهذه المنهجية هو تقييم إنزيمات متعددة باستخدام نظام فحص واحد عالي الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكائنات الحية الدقيقة والهندسة الحيوية حول الفحص الميتاجينومي وهندسة الإنزيمات. لقد طورنا نظاما لفحص الإنزيم الجيني يتكون من مركب الفينيلين المتحور MPL المسؤول عن مراسل GFP النهائي.

بمجرد أن يظهر أي جين ميتاجينومي نشاط الإنزيم الذي يثير اهتمامنا من خلال التفاعل مع الركيزة المتوفرة ، فإن مركب فينيلين من منتج التفاعل ينشط طفرة Dmp ويؤدي إلى تعبير مراسل GFP الذي يمكن التقاطه بسهولة بواسطة مقياس التألق. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه على عكس تقنيات الفحص التقليدية ، فإن هذه الطريقة الفردية قابلة للتطبيق لفحص أنواع متعددة من الإنزيمات المختلفة باستخدام الركيزة المناسبة. سيظهر هذا الإجراء كيل كوانغ كوون ، طالب دراسات عليا في مختبرنا.

بعد إنشاء مكتبة ميتاجينومية في بكتريا قولونية باستخدام ناقل fosmid باستخدام مجموعة إنتاج مكتبة fosmid ، انقل الحمض النووي pgess (E135K) إلى خلايا مكتبة الميتاجينومية. ثم قم بتخزين خلايا المكتبة المحولة عند 70 درجة مئوية تحت الصفر و 20 ميكرولتر من الحصص المئوية. لإزالة الإيجابيات الخاطئة ، قم أولا بإذابة خلية مكتبة ميتاجينومية على الجليد.

ثم قم بتلقيح عشرة ميكرولترات من الخلايا المذابة في ملليلترين من مرق الليسوجينات المحتوي على الأمبيسلين والكلورامفينيكول في أنبوب دائري القاع سعة 14 مليلتر عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات. وفي الوقت نفسه ، قم بتعيين المعلمات المناسبة على جهاز FACS لقراءة خلايا مكتبة الميتاجينومية في برنامج FACS الافتراضي. في نهاية الحضانة ، انقل خمسة ميكرولترات من الخلايا إلى مليلتر واحد من PBS في أنبوب دائري القاع سعة خمسة ملليلتر.

بعد ذلك، قم بتحميل عينة المكتبة المخففة واضبط معدل الحدث على 1000 إلى 1500 حدث في الثانية. لإنشاء منطقة تشتت أمامية مصغرة السجل مقابل مخطط مبعثر منطقة مبعثرة جانبية متفرقة على ورقة عمل عمومية، قم بإنشاء مخطط نقطي ورسم بوابة مضلع حول الأحداث المفردة التي تحتوي على مجموعة البكتيريا. لرسم عدد الخلايا مقابل الرسم البياني لمنطقة FITC المتدرج في السجل ، افتح الرسم البياني واضبط جهد FITC بحيث تكون ذروة التوزيع على شكل جرس أقل من عشرة إلى اثنين من منطقة FITC.

بعد ذلك ، افتح مخططا نقطيا آخر لإنشاء منطقة مبعثر أمامية بمقياس لوغاريتمي مقابل مخطط منطقة FITC السجل وتعيين بوابة فرز R2 بين زائد خمسة وناقص خمسة بالمائة من الخلايا من مركز التوزيع. عندما يتم ضبط جميع البوابات ، ضع أنبوب تجميع يحتوي على 1.2 مل من مرق الليزوجينات المكمل بالمضادات الحيوية عند مخرج أداة FACS وفرز مرة واحدة في عشرة إلى سادس الخلايا المسورة في المرق. في نهاية الفرز ، قم بتغطية أنبوب التجميع وقم بدوامة الخلايا برفق.

لفحص الإنزيمات الميتاجينومية ذات الأهمية ، احتضان الخلايا التي تم فرزها عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 إلى 0.5 ، ثم أضف ميكرولتر واحد من محلول تحريض النسخ لتضخيم رقم نسخة fosmid داخل الخلية. بعد ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة ، اجمع بين 0.5 مل من الخلايا مع الركيزة المناسبة في أنبوب دائري القاع سعة 14 مليلتر إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومولار. ثم احتضان العينات الضابطة والتجريبية عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث ساعات أخرى.

أثناء اهتزاز العينات، قم بتعيين معلمات جهاز FACS كما هو موضح للتو. ثم أضف خمسة ميكرولترات من الخلايا من كل عينة إلى أنابيب فردية مستديرة القاع سعة خمسة ملليلتر تحتوي على مليلتر واحد من PBS. بعد ذلك، قم بتحميل خلايا العينة وقم بتعيين معدل الحدث إلى 1000 إلى 3000 حدث في الثانية.

قم بإنشاء منطقة مبعثر أمامية ذات مقياس سجل مقابل مخطط مبعثر منطقة التشتت الجانبية ذات الحجم اللوغاريتمي واضبط بوابة التشتت R1 لتشمل الخلايا البكتيرية للحدث الفردي. ثم قم بإنشاء مخطط مبعثر أمامي مسجل مقابل مخطط مبعثر منطقة FITC بمقياس السجل وقم بتعيين بوابة فرز R2 بحيث يتم اكتشاف أقل من 0.1٪ من الخلايا السالبة. الآن ، قم بتحميل أنبوب العينة وأعد ضبط معدل الحدث إلى 1000 إلى 3000 حدث في الثانية ، حسب الضرورة.

ثم ضع أنبوب تجميع يحتوي على 0.5 مل من مرق الليسوجينات عند مخرج أداة FACS واجمع واحدا في عشرة إلى ربع الخلايا داخل بوابات R1 و R2. عندما يتم عزل جميع الخلايا ، قم بتغطية أنبوب التجميع وقم بدوامة الخلايا برفق. ثم انشر 0.5 مل من العينات التي تم جمعها على لوحين أجار عيار 90 ملم يحتويان على مرق ليسوجينات مكمل بالمضادات الحيوية ثم احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في هذا الشكل ، يتم توضيح بروتوكول الفحص المبين بما في ذلك إزالة الإيجابيات الخاطئة عن طريق الفرز السلبي ، واختيار النتيجة الإيجابية باستخدام بوابات الفرز R1 و R2. يمكن بعد ذلك تقييم الضربات من خلال مقارنة إزهار العينة مع الركيزة وبدونها. في هذا الفحص التمثيلي بوساطة أسيتات p-nitrophly ، كان إزهار الخلايا المعالجة بالركيزة أعلى من خلايا التحكم ، مما يؤكد خمسة مرشحين للليباز في هذه التجربة.

على الرغم من التوزيعات الواسعة لهذه المرشحات الثلاثة للسليلوز ، لوحظت اختلافات واضحة في متوسط كثافة FITC للسكان. تظهر هذه المرشحة الأربعة للفوسفاتيز أيضا مستويات عالية من الإزهار مقارنة بخلايا التحكم. علاوة على ذلك ، يمكن تأكيد نشاط الفوسفاتيز القلوي لنواقل orf المدخلة عن طريق قياس التدفق الخلوي مع إشارة إزهار أقوى لوحظت للإنزيم المصاب مقارنة بالخلايا التي تحمل البلازميد الفارغ.

من المهم أن تتذكر أنه يمكن تطبيق هذه التقنية على فحص مجموعة واسعة من الإنزيمات عن طريق اختيار ركيزة مناسبة وتركيز حصة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي للإجابة على أسئلة إضافية حول تحديد وتوصيف الإنزيم المرشح بطريقة عالية الإنتاجية. بعد تطويرها ، مهدت تقنية فحص الإنزيم عالية الإنتاجية هذه الطريق للباحثين في مجال هندسة الإنزيمات لاستكشاف العديد من الإنزيمات الميتاجينومية دون الحاجة إلى خصوصية الإنزيم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام الفحص عالي الإنتاجية القائم على الدائرة الميتوجينية مع مجموعة واسعة من أهداف الإنزيم.