الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء نسيج غضروفي بشري ثلاثي الأبعاد لاختبار جدوى طباعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، باستخدام طابعة نافثة للحبر حرارية معدلة مع بلمرة صور متزامنة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعديل طابعة نفث الحبر الحراري Hewlett Packard النفاثة المكتبية 500 المتوفرة تجاريا و 5 1 16 2 6 ، خرطوشة حبر أحادية اللون إلى طابعة حيوية. الخطوة الثانية هي الجمع بين مرحلة الطباعة ثلاثية الأبعاد البسيطة ومصباح الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي طويل لتوفير بلمرة فورية للحبر الحيوي المحقون أثناء عملية التصنيع.

بعد ذلك ، يتم تحضير الحبر الحيوي عن طريق تعليق الخلايا الغضروفية المفصلية البشرية الموسعة في محلول البولي إيثيلين جلايكول بنسبة 10٪ عند 5 ملايين خلية لكل مليلتر. الخطوة الأخيرة هي طباعة أنسجة الغضروف في طبقة تلو الأخرى مع بلمرة الصور المتزامنة. في نهاية المطاف الفحص المجهري متحد البؤر وعلم الأنسجة.

يستخدم التلوين لإظهار التوزيع المتساوي للخلايا الغضروفية المطبوعة في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد وإنتاج مصفوفة غضروفية ممتازة خارج الخلية في الغضروف الجديد المتجانس أثناء الثقافة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التدابير الحالية مثل البلمرة بعد التصنيع اليدوي أو الخلايا الجالسة بعد الفحص بحثا عن التصنيع هي أن الخلايا المطبوعة يتم تسليمها بدقة إلى موقع اللمس وتبقى في موضعها في المصفوفة. بدلا من التفكير في الجزء السفلي من السقالة بسبب الجاذبية ، فإنها تشكل خرطوشة متجانسة.

تعديل الطابعة الموضح في هذا الفيديو على طابعة نفث الحبر الحراري Hewlett Packard النفاثة المكتبية 500 وخرطوشة حبر سوداء 5 1 6 2 6. ابدأ بإزالة الغطاء البلاستيكي العلوي للطابعة وفصل لوحة التحكم بعناية عن الغطاء. افصل توصيلات الكابلات الثلاثة بين الجزء العلوي من الطابعة والقاعدة.

ثم قم بإزالة الجزء العلوي من الطابعة من القاعدة. بعد ذلك ، تتم إزالة الملحقات البلاستيكية والمطاطية الصغيرة التي تشكل نظام تنظيف رأس الطباعة من الجزء العلوي من الطابعة. قم بإزالة قاعدة درج الورق بالنوابض.

يجب أيضا إزالة اللوحة المعدنية التي تغطي قضيب تغذية الورق البلاستيكي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب قطع قضيب تغذية الورق البلاستيكي في موضع عجلة التغذية الوسطى وإزالة عجلتي تغذية الورق. لغرض هذا الفيديو ، تمت إزالة هذه المكونات بالفعل.

بعد تنظيف الغبار والحطام باستخدام مناديل الهواء والإيثانول المعلبة ، قم بتوصيل الجزء العلوي من الطابعة بالقاعدة قبل استخدام الأشعة فوق البنفسجية. تعقيم الطابعة المعدلة لمدة ساعتين على الأقل في غطاء التدفق الصفحي. لتعديل خرطوشة الحبر ، قم أولا بقطع غطاءها.

باستخدام منشار يدوي ، أفرغ الحبر وقم بإزالة الفلتر الذي يغطي خزان البئر السفلي للخرطوشة. اشطف الخرطوشة جيدا بماء الصنبور الجاري لإزالة الألتراس المتبقية من الحبر. قم بتقطيع الخرطوشة في الماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق.

افحص الخرطوشة للتأكد من إزالة الحبر بالكامل. رش الخرطوشة جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول للتعقيم ، متبوعا بالماء المعقم منزوع الأيونات. أخيرا ، قم بإعداد مصباح UV طويل الطول الموجي فوق منصة الطباعة لتوفير قدرة بلمرة الصور المتزامنة.

قم بقياس شدة الأشعة فوق البنفسجية في منصة الطباعة باستخدام مقياس ضوء الأشعة فوق البنفسجية. اضبط المسافة بين مصباح الأشعة فوق البنفسجية ومنصة الطابعة ، بحيث تتراوح شدة موضوع الطباعة بين أربعة إلى ثمانية مللي واط لكل سنتيمتر مربع. يجب أن تكون هذه المسافة بين المصباح ومنصة الطابعة حوالي 25 سم.

يتم تحضير الحبر الحيوي من الخلايا الغضروفية البشرية لتوسيع الخلايا الغضروفية في صفيحة أحادية الطبقة. 5 ملايين خلية غضروفية بشرية في كل قارورة ثقافة نسيجية T 1 75 لتوسيع الخلايا في DMEM مكملة بمصل ربلة الساق 10٪ وخلايا زراعة الجلوتامين ستربتومايسين بنسلين عند 37 درجة مئوية مع هواء مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير وسط الثقافة كل ثلاثة أيام حتى تتماسك الخلايا بنسبة 85٪.

استخدم خلايا من نفس المقطع. تحضير محلول البولي إيثيلين جلايكول DL أو بيدا. قم بإذابة البيدا في PBS إلى تركيز نهائي قدره 10٪ من الوزن لكل حجم.

أضف بادئ الصور I 2 9 5 9 إلى التركيز النهائي بنسبة 0.05٪ الوزن لكل مرشح حجم. عقم المحلول عندما تكون الخلايا الغضروفية البشرية المستنبتة ملتقية بنسبة 85٪. اجمع الخلايا بعد حساب تركيز الخلية.

انقل حجم تعليق الخلية اللازم لإعداد الحيوية عند 5 ملايين خلية لكل مليلتر إلى جهاز طرد مركزي أنبوبي مخروطي الشكل بسرعة 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. لتكوير الخلايا ، قم بشفط المادة الطافية وتعليق الخلايا في محلول Pega المحضر لتشكيل الحبر الحيوي. لبدء هذا الإجراء ، قم بتشغيل الطابعة والكمبيوتر المحمول باستخدام Microsoft Word ، وقم بإنشاء نمط طباعة لدائرة صلبة بقطر أربعة ملليمترات.

ضع القالب البلاستيكي في الطابعة. اضبط موضع النموذج وتأكد من طباعته بالضبط في القالب البلاستيكي. احسب عدد المطبوعات اللازمة للوصول إلى السماكة المطلوبة للسقالة.

لارتفاع أربعة ملليمترات ، يلزم وجود 220 مطبوعة لإنشاء السقالة المطلوبة. قم بتحميل الحبر الحيوي في خرطوشة الحبر. قم بتغطية الخرطوشة بورق الألمنيوم للحماية من التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية.

أثناء الطباعة، أرسل أمر الطباعة إلى الطابعة. عندما تبدأ الطابعة في الطباعة، اسحب مستشعر الورق لمتابعة الطباعة. في حالة عدم مرور الورق عبر الطابعة ، يجب أن تستغرق عملية الطباعة بأكملها أقل من أربع دقائق لسقالة قطرها أربعة ملليمترات وارتفاع أربعة ملليمترات.

انقل الغضروف الجديد المطبوع إلى صفيحة 24 بئر وأضف 1.5 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر. لتقييم صلاحية الخلية ، احتضان الغضروف الجديد المطبوع في قابلية الحياة الميتة الحية. حل عمل السمية الخلوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام ، قم بقطع الهيدروجيل المحمل بالخلية إلى نصفين بعد الحصول على صور فلورية لمنطقة القطع ، اطلب من مراقب أعمى حساب الخلايا الحية والميتة في خمس صور تم التقاطها عشوائيا لحساب صلاحية الخلية.

في هذه الصورة نسيج غضروفي جديد مطبوع ممثل بقطر أربعة ملليمترات وارتفاع أربعة ملليمترات بناء على خصائص طابعة نفث الحبر الحرارية المعدلة. بالنسبة لبناء بهذا الحجم ، كان حجم وسمك كل طبقة مطبوعة أثناء بناء طبقة تلو الأخرى 0.23 ميكرولتر و 18 ميكرون على التوالي. استغرقت عملية الطباعة بأكملها لبناء أنسجة الغضروف الجديد أقل من أربع دقائق.

هذه الصور لخلايا غضروفية مصنفة بأصباغ فلورية خضراء وبرتقالية. تظهر اللوحة A توزيعا متساويا للخلايا الغضروفية المطبوعة في السقالة ثلاثية الأبعاد. نظرا للبلمرة الضوئية المتزامنة للسقالة المحيطة أثناء ترسيب الخلية ، تم الانتهاء من عملية الطباعة والبلمرة الضوئية في أربع دقائق مع بقاء الخلية بنسبة 90٪ على النقيض من ذلك ، توضح اللوحة B أنه بدون بلمرة الصور المتزامنة ، بدلا من البقاء في مواقعها المودعة في البداية ، غرقت الخلية في الواجهة الأفقية السفلية بسبب الجاذبية.

استغرق الأمر 10 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية للهلام ، وهو بناء من نفس حجم A مع قابلية خلية للحياة تبلغ 63٪ من الزعفران و o تلطيخ الخلايا الغضروفية المطبوعة في هيدروجيل PEG يظهر زيادة تدريجية في إنتاج الجليكان البروتيني أثناء الثقافة مما يشير إلى النمط الظاهري المتشكل للخلايا الغضروفية المطبوعة في 3D وتشكيل غضروف جديد متجانس. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام طابعة نفث الحبر الحراري المعدلة لإنشاء أنسجة محسوبة ثلاثية الأبعاد مع توزيع متساو للخلايا في سقالة ثلاثية الأبعاد.