التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة التفاعل بين بروتينين وخلايا مستنبتة حية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الاستنساخ الفرعي ل CDNAs للبروتينين المعنيين في البلازميدات التي تحتوي على تسلسل الطلاء لوسيفيراز أو بروتين الفلورسنت الأصفر ، المختصر YFP لإنشاء نواقل للتعبير عن البروتين في خلايا الثدييات. كخطوة ثانية ، يتم نقل البلازميدات إلى خلايا مستنبتة ، مما يؤدي إلى التعبير عن بروتينات اندماج YFP و luciferase.

بعد ذلك ، تتم إضافة ركيزة لوسيفيراز إلى الخلايا من أجل بدء انبعاث الضوء من اللوسيفيراز. تم الحصول على النتائج التي تظهر التفاعل بين بروتيني الاندماج بناء على نقل الطاقة من LUCIFERASE إلى YFP. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل ترسيب الأمطار ، هي أنها تسمح بملاحظة تفاعلات البروتين البروتيني في الخلايا الحية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الجينوم الوظيفي من خلال تحديد ما إذا كانت الطفرة الموجودة في المريض تؤثر على تفاعلات البروتين البروتيني. يوضح الخطوة الأولى من الإجراء هو RAB tric ، طالب دكتوراه من مختبري للبدء في إنشاء البلازميدات كما هو موضح في بروتوكول النص. تقدير تركيزها بناء على الامتصاص عند 260 نانومتر.

حدد الكتلة الجزيئية لكل بلازميد بضرب عدد أزواج القواعد في 650. استخدم التركيز والكتلة الجزيئية لحساب التركيز المولي لكل مستحضر بلازميد. تمييع مستحضرات الحمض النووي البلازميد إلى تركيز 36 نانو مولار.

ستكون هذه هي مخزونات العمل التي سيتم استخدامها لتحضير خلطات الحمض النووي. للتعداد. أصعب جانب في هذا الإجراء هو إعداد خلطات الحمض النووي لضمان النجاح ، نقوم بإنشاء جداول بيانات لحساب الكمية الصحيحة لكل مكون مسبقا ، ونتوخى الحذر الشديد.

في إعداد مزيج DN. تحضير أول مزيج تحكم للحمض النووي يحتوي على 1800 نانوجرام من بلازميد الحشو في حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر من الماء. ثم قم بإعداد مزيج ثان من الحمض النووي المتحكم فيه عن طريق تحضير خمسة ميكرولترات من بنية التحكم في المظهر P.

أضف بلازميد الحشو ليصل إجمالي كتلة الحمض النووي إلى 1800 نانوجرام. أضف الماء ليصل الحجم النهائي إلى 20 ميكرولترا. قم بإعداد مزيج تحكم ثالث من الحمض النووي يحتوي على خمسة ميكرولترات من بنية التحكم في المظهر P ، وخمسة ميكرولترات من بنية التحكم في PYFP.

أضف حشو البلازميد والماء كما كان من قبل. أخيرا ، قم بإعداد مزيج رابع للتحكم في الحمض النووي يحتوي على خمسة ميكرولترات من بنية التحكم الإيجابية. مرة أخرى ، أضف الحشو والبلازميد والماء بنفس الطريقة.

بعد ذلك ، قم بإعداد خلطات 3D NA لاختبار تجانس البروتين ذي الأهمية x. لكل مزيج من الحمض النووي ، اجمع بين خمسة ميكرولترات من بنية P ذات الصلة وخمسة ميكرولترات من بنية PYFP ، مع إضافة بلازميد الحشو والماء. ثم قم بإعداد خلطات الحمض النووي لاختبار التفاعل بين زوج من البروتينات ذات الأهمية X و Y.لكل مزيج من الحمض النووي ، اجمع بين خمسة ميكرولترات من بناء P look ذي الصلة وخمسة ميكرولترات من بناء PYFP جنبا إلى جنب مع حشو البلازميد وحصاد المياه sub confluent hec 2 9 3 خلايا من قارورة 75 سم مربع تمييع 10٪ من إجمالي الخلايا إلى 13 مل من وسط الاستزراع.

ثم قم بتوزيع 130 ميكرولترا من معلق الخلايا في كل بئر من صفيحة زراعة أنسجة البئر البيضاء ذات القاع الشفاف 96 قبل زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، احسب عدد الآبار المراد نقلها بضرب عدد خلطات الحمض النووي في ثلاثة. قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على 6.3 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة ، ووسط خال من المصل ، و 0.18 ميكرولتر من كاشف التعدي لكل بئر ممزوج بالدوامة قبل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم تم توزيع 20 ميكرولترا من مزيج كاشف التعداء المتوسط الخالي من المصل في العدد المطلوب من الأنابيب. أضف ميكرولترين من مزيج الحمض النووي المقابل في كل أنبوب ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أخيرا ، قم بعمل ثلاثة آبار مع كل مزيج تعداد.

توزيع 6.5 ميكرولتر من مزيج التعداء لكل بئر قبل زراعة الخلايا لمدة 36 إلى 48 ساعة أخرى. لقياس إشارة BRET. قم أولا بإذابة ركيزة لوسيفيراز الخلية الحية بمعدل 34 ملليغرام لكل مليلتر في DMSO عن طريق الدوامة.

تمييع الركيزة لوسيفيراز الخلية الحية المعاد تشكيلها عند واحد إلى 1000 في وسط تخفيف الركيزة 37 درجة مئوية. اترك 50 ميكرولترا من وسط تخفيف الركيزة لكل دوامة بئر للخلط. قد يتشكل الراسب ، لكنه لن يتداخل مع الفحص.

استنشاق وسط الثقافة من لوحة البئر 96 ، وقم بتوزيع 50 ميكرولترا من ركيزة لوسيفيراز الخلية الحية المخففة في كل بئر بعد زراعة الخلايا لمدة ساعتين على الأقل. قم بإزالة الغطاء من لوحة البئر 96 واحتضان اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة داخل مقياس الإلواء. قم بقياس الانبعاث من LUCIFERASE و YFP واحدا تلو الآخر وفقا للتفاصيل الواردة في بروتوكول النص ، وقم بدمج إشارات الانبعاث على مدى 10 ثوان.

يلعب أعضاء عائلة Fox P من مثبطات النسخ دورا في نمو الدماغ. تورطت الطفرات في اضطرابات طيف النطق والتوحد. من المعروف أن FOX P two يشكل متجانسات للتحقق من صحة اختبار بريت للكشف عن الثعلب.

P تم نقل خليتين من خلايا Homodimers بتركيبات للتعبير عن لوسيفيراز كمتبرع أو YFP كمتقبل مدمج إما في Fox P two أو إشارة توطين نووية. تعمل بروتينات LUCIFERASE و YFP النووية المستهدفة كعناصر تحكم سلبية كعنصر تحكم إيجابي للكشف عن بريت. تم أيضا نقل خلايا الإشارة ببناء للتعبير عن بروتين اندماج لوسيفيراز YFP.

تظهر الزيادة في إشارة BRET أن اختبار Bret فعال في الكشف عن صور الفحص المجهري الفلوري Fox P اثنين من المتجانسات للخلايا المنقولة مع YFP المدمجة في إشارة توطين نووية ، أو مع YFP المنصهر في FOX P يتم عرض اثنان هنا. تم إثبات خصوصية التفاعل من خلال إدخال طفرة في FOX P two ، والتي من المعروف أنها تعطل الثنائية. عندما تم التعبير عن لوسيفيراز Fox P اثنين من دلتا E 400 و YFP Fox B ، تم التعبير عن بروتينين اندماجيين.

لوحظ انخفاض في إشارة التنفس مقارنة بالوقت الذي تم فيه التعبير المشترك عن Fox B two و YFP Fox B اثنين. لم يكن هذا الانخفاض في الإشارة بسبب تغيير في التوطين الخلوي للبروتين المتحور لتقييم فعالية مقايسة بريت في الكشف عن التفاعلات النموذجية ، فقد تم اختبار تفاعل Fox P two مع Fox P one ، ولوحظت إشارة بريت في كلا التكوينين المحتملين للمقايس. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار مدى ملاءمة اختبار بريت أو الكشف عن تفاعل Fox P two مع بروتينات غير FOX P من خلال فحص التفاعل مع CT BP one ، وهو مثبط مشارك نسخي وشريك تفاعل Fox P two المعروف.

تم اكتشاف تفاعل Fox P two CT BP بواسطة اختبار Brett عندما كان Fox P two هو بروتين اندماج المتبرع و CT P واحد هو المتقبل ، ولكن ليس في التكوين العكسي. لوحظ التفاعل بين FOX P two و CT P one على الرغم من أن نسبة طفيفة فقط من CT BP واحد كانت مترجمة إلى النواة مما يسلط الضوء على حساسية هذا الفحص. أخيرا ، تم استخدام اختبار بريت لفحص آثار الطفرات المسببة للأمراض في Fox P two على تفاعلات البروتين البروتيني.

الإبلاغ عن طفرتين نقطتين في Fox P Two لتسببان اضطرابا وراثيا سائدا نادرا يؤثر على الكلام واللغة. تم تقييم قدرة البروتينات الطافرة على التثلئة مع الثعلب البري P two باستخدام مقايسة BRET. إن R 3 28 X ، ولكن ليس طفرة R 5 53 H ، تعطل النتائج باستخدام النوع البري Fox B two كمتبرع والمتحولة Fox B two.

كما هو موضح في المستقبل ، لوحظت نفس النتائج للتكوين العكسي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق مقايسة الخبز لمراقبة تفاعلات البروتين البروتيني. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا الحية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات إضافية لفحص نشاط البروتين الذي يثير اهتمامك من أجل تقييم العواقب الوظيفية لتفاعل بروتين البروتين المرصود.