الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

تهدف هذه التجربة إلى تحديد ما إذا كان هناك بروتينان يتفاعلان في الخلايا وتحديد جوانب مواقع هذا التفاعل. يتم نقل الخلايا الأولى بتركيبات تعبيرية تشفر البروتينين المعنيين ، أحدهما يندمج في الطرف النهائي لبروتين فلوري مجزأ والآخر يندمج في الطرف C التكميلي لبروتين الفلورسنت المجزأ. بعد السماح للخلايا المنقولة بتطوير إشارة الفلورسنت في الثقافة ، يتم تصور مجمعات البروتين عن طريق التصوير والنشاف المناعي.

بعد ذلك ، يتم تصدير الصور التي تم جمعها إلى برامج تصوير مثل Image J من أجل تحديد متوسط شدة التألق لكل خلية في تجربة خاضعة للرقابة ، يمكن أن توضح نتائج BIFC تفاعلات بروتين البروتين وتوطين هذه المجمعات ، مثل المجالات الثلاثة SH لبروتين السقالة المتقاطعة والمجال الغني للمحترفين من PI three KC two beta. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التحديد المشترك ، والترسيب المناعي ، والحنق ، هي أن BFC يسمح بالتوطين المكاني للتفاعلات العابرة الأضعف في الخلية. وهذه الطريقة لا تتطلب صورا شاملة لما بعد المعالجة كما هو موضح مع الحنق.

يمكن لهذه الطريقة معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال نقل الإشارة ، مثل تفاعل بروتينات DO X و Y ، وإذا كان الأمر كذلك ، فما هي المقصورات المحددة التي يتم توطين هذه المجمعات فيها في الخلية؟ بشكل عام ، سيكافح الوافدون الجدد إلى هذه الطريقة لأنهم لم يختاروا التكوين المناسب للتعبير عن خزعة. البروتينات ذات الأهمية المعلمة ابدأ باختيار أحد الفلوروفورات المتعددة لبروتينات اندماج BIFC.

ضع في اعتبارك أن الأطراف الأمينية والكربوكسية لكوكب الزهرة قادرة على تكوين مركب عند 37 درجة مئوية بينما تتطلب شظايا Y-F-P-B-I-F-C حضانة مسبقة عند 30 درجة مئوية. تصميم متجهات التعبير لإضافة العلامة إلى البروتينات ذات الأهمية من خلال النظر في كيفية تأثير ربط شظايا BIFC على وظيفة البروتينات ذات الأهمية. على سبيل المثال ، عائلة RAs ، GTP a هي دهون معدلة في نهاية الكربوكسي ولا يمكن تمييزها في هذه النهاية دون تعطيل هذا التعديل.

قم دائما بإجراء تجارب تجريبية لتحديد ظروف التعداد. قم أيضا بمراقبة الخلايا عن طريق الفحص المجهري الفلوري لتحديد الوقت الأمثل لتطوير الإشارة. ثم قم بإجراء تحليل الزهرة الغربية لتأكيد التعبير المتساوي عن البنيات.

الأهم من ذلك ، وصمة عار مناعية ل HA أو علامة العلم للتحقق من أن إضافة شظايا BIFC لا تغير التوطين الخلوي للبروتينات ذات الأهمية لكل لوحة عينة. 1.3 مرة 10 من الخلايا الخمس تسبب كل منها على صفيحة واحدة من الزجاج السفلي واثنين من صفيحة ستة آبار والسماح للخلايا بالاستقرار طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية في اليوم التالي. تحضير الحمض النووي للتعداء عن طريق استئصال الدهون أو أي طريقة أخرى مفضلة.

أولا ، قم بتخفيف الحمض النووي في 250 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل كعنصر تحكم في التعدين. أضف CFP عند 50 ، وهو مقدار إجمالي الحمض النووي ل BIFC. الآن قم بتخفيف الشفة في 250 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل باستخدام 10 ميكرولتر من الشفاه لكل ميكروغرام واحد من الحمض النووي.

امزج الحمض النووي وتخفيفات الشفاه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اشطف الخلايا مرتين باستخدام DMEM الدافئ الخالي من السيروم. أضف ملليلترين من DMEM الخالي من المصل إلى كل صفيحة سفلية زجاجية أو بئر من ستة أطباق جيدة.

ثم قسم كل خليط تعداء بالتساوي بين طبق زجاجي واحد وبئرين من ستة. تحتضن صفيحة البئر الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. أخيرا ، قم بإزالة وسائط التعدين واستبدلها بوسائط DMEM كاملة بالإضافة إلى 10٪ FBS.

احتضان الخلايا للوقت المحدد في التجارب التجريبية للحصول على مستويات التعبير اللازمة للبروتينات ذات الأهمية. افحص الخلايا المنقولة تحت مجهر فلورسنت epi للتأكد من أن التحكم الإيجابي هو الفلورسنت. اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لتصوير الخلايا الحية.

ضع الخلايا في الوسائط التي تفتقر إلى قوالب المؤشر. لتصوير الخلايا الثابتة. أضف 2٪ بارا فورمالديهايد وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق.

ثم اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS مغطى الآن بملليلتر واحد من PBS وتخزينه في الظلام عند أربع درجات مئوية ، ثم قم على الفور بتجميع الخلايا في طبق البئر الستة. بالنسبة لتحليلات اللطخة الغربية ، من المهم أن يتم تحضير جميع الخلايا في نفس الوقت بحيث تكون خلايا ليز ممثلة لخلايا الصورة. قم بإجراء لطخة غربية للتأكد من التعبير عن بروتينات العلامة بمستويات متساوية.

عند تصوير الخلايا باستخدام مجهر متحد البؤر ، من المهم الحفاظ على الإعدادات ثابتة طوال التجربة بحيث يكون التألق قابلا للمقارنة بين العينات. تأكد من تصوير الخلايا الفردية حيث لا تكون وحدات البكسل مشبعة. نظرا لأنه تم تضمين CFP كعنصر تحكم في التعدي ، حدد فقط الخلايا الموجبة CFP لتحليل إشارات BIFC.

قم بقياس التألق باستخدام برنامج التصوير مثل الصورة J.افتح ملفات الصور في Image J.Go لتحليل القياسات المحددة. حدد المربعات الخاصة بالمساحة ومتوسط القيمة الرمادية في مربع القياسات. لاحظ أنه في هذا المثال ، كانت الصور الوريدية ملونة زائفة باللون الأخضر وصور CFP ، واللون الأحمر الزائف.

باستخدام أداة التحديد اليدوي ، ارسم مخططا حول حافة الخلية بأكملها في قناة CFP مع ترك هذا المخطط في مكانه. انتقل إلى قناة YFP. انتقل إلى التحليل ، وقم بقياس متوسط القيمة الرمادية التي تعكس متوسط شدة التألق لكل خلية لكل صورة.

ارسم دائرة في قناة YFP في منطقة لا تحتوي على خلية. خذ قياسا لهذه المنطقة كخلفية. اطرح الخلفية من كل صورة.

أخيرا ، لحساب متوسط شدة التألق لمجموعة من الخلايا ، متوسط قيمة الدرجة مطروحا منها خلفية جميع الخلايا المصورة في عينة واحدة. من الناحية المثالية تحديد 60 خلية على ثلاث تجارب. ينظم بروتين السقالات متعدد المجالات المتقاطعة بقاء الخلايا العصبية من خلال تنظيم جديد من الفئة الثانية PI ثلاثة كيناز ، PI ثلاثة KC ، اثنان بيتا متقاطعة SH ، ثلاثة مجالات تتفاعل مع المنطقة الغنية بالبرولين الطرفية الأمينية من PI ثلاثة KC ، تعداء بيتا من VN الموسومة ، تتقاطع مع VC الموسومة PI ثلاثة KC اثنين بيتا في إشارة فلورية في قناة YFP ، وهو لون أخضر زائف يشير إلى التكوين المعقد.

يتم استخدام CFP الزائفة الملونة هنا باللون الأحمر كعنصر تحكم لتمييز طفرات الخلايا المنقولة في المجال الغني بالبرولين من PI three KC two beta ، مما يعطل هطول الأمطار المشترك للتقاطع و PI ثلاثة KC اثنين من بيتا يقلل من إشارة BIFC. لا يرجع هذا الاختلاف في إشارة BIFC إلى الاختلافات في التعبير عن النوع البري وبروتينات PA PI three K بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، عليك أن تتذكر تشغيل عناصر التحكم المناسبة والتحقق من تعبير البروتين للتأكد من أن الاختلافات في إشارة BC ناتجة عن اختلافات في التكوين المعقد وليست بسبب التعبير بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل البلازما السطحية على السكان من أجل الإجابة على أسئلة مثل ما هي الصلات المختلفة لهذه المجمعات مع بعضها البعض؟