Name: الإسفار التكملة ثنائي الجزيء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: اكتشف تقنية الإسفار التكاملي ثنائي الجزيء لدراسة تفاعلات البروتينات ومواقعها داخل الخلايا الحية. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تصوير التفاعلات الضعيفة والعابرة بدقة مكانية عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وITSN ، PI3K C2β ، وناقلات التحكم المستخدمة في هذا البروتوكول متاحة من الكتاب بناء على طلبها ، لأغراض غير تجارية فقط. الكتاب نود أن ننوه الدكتور تشانغ دينغ هو جين تاو لتقديم المشورة وتتكرم الكواشف المستخدمة في إنشاء بروتوكول BiFC في المختبر O&#39;Bryan. وأيد كاو من خلال تمويل من مؤسسة جيروم لوجون. ويدعم العمل في المختبر O&#39;Bryan من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وزارة الدفاع (HL090651) (PR080428) ، مؤسسة Baldrick سانت ، وجيروم لوجون المؤسسة.

ألف BiFC المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار fluorophore هناك fluorophores متعددة ، مثل YFP والزهرة ، التي تعمل بشكل جيد كشركاء الانصهار BiFC (الجدول 1). تاريخ الأمينية وكربوكسي محطة - فينوس قادرون على تشكيل المجمع في 37 درجة مئوية ، في حين أن شظايا BiFC YFP تتطلب الحضانة في مرحلة ما قبل 30 درجة مئوية وذلك لتسهيل تشكيل fluorophore 2. قد يكون هذا الاحتضان في درجة حرارة منخفضة تغيير بعض العمليات الخلوية وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند اختيار شظايا. نواقل التفجير فينوس إلى محطة كربوكسي البروتينات المتوفرة من Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ؛ seepBiFC - VN173 وpBiFC VC155) جنبا إلى جنب مع ثوابت إضافية لاستخدامها في الضوابط ، وعلى سبيل المثال ، <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a> وpBiFC bFosVC155 - 2. ناقلات إضافية ، بما في ذلك ناقلات فينوس المطراف الأميني (VN173 وpFLAG - PHA VC155) ، متاحة على الموقع التالي : <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ /</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلامة البروتين من الفائدة. وتنصهر وشظايا BiFC إلى أقاصي الأمينية أو كربوكسي المحطة ، من البروتينات مرشح. بعض البروتينات قد لا تسمح لوضع علامات على طرفي بسبب اضطراب في وظيفة البروتين. على سبيل المثال ، العديد من أعضاء الفصيلة من رأس GTPases يتم تعديل المادة الدهنية في المرفق كربوكسي محطة النافية بالتالي شظايا BiFC في تحقيق هذه الغاية. وهكذا ، فإنه من المهم أن يكون فكرة عن كيفية الحجز على شظايا BiFC قد تؤثر على وظيفة من البروتينات المثيرة للاهتمام. وينبغي إذا كان من غير الواضح كيف علامات البروتين سيؤثر يتم اختبار تركيبات وظيفتها متعددة. بالإضافة إلى جزء BiFC ، قد يتم تضمين رابط الببتيد لزيادة المرونة بين fluorophore مجزأة والبروتينات مرشح. في حين أن الاستنساخ مواقع متعددة (MCS) في ناقلات BiFC ترميز قصيرة تمتد من الأحماض الأمينية التي يمكن أن توفر قدرا كافيا من المرونة ، وRSIAT ، KQKVMNH وlinkers RPACKIPNDLKQKVMNH وقد استخدمت بنجاح في التجارب BiFC 3،9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد شروط ترنسفكأيشن قبل اختبار طفرات متعددة ، وينبغي إجراء تجارب مراقبة قليلة. الأولين تركيبات BiFC التي يجب أن يحاكم واثنين من البروتينات النوع البري التي هي معروفة للتفاعل ونوع واحد البرية والمسخ التي لا تتفاعل. تستخدم هذه المجموعات يتعين عليهما أن كميات مختلفة من اختبار الحمض النووي وتحديد أوقات ترنسفكأيشن الظروف المثلى للكشف عن إشارة BiFC للبروتينات مرشح. نقترح اختبار 0.25ug ، 0.5ug ، 1.0ug كل بناء BiFC لفترة واحدة جيدا 6 طبق بشكل جيد. بعد يوم من الخلايا بواسطة المجهر مراقبة ترنسفكأيشن مضان لتحديد الوقت الأمثل لتحقيق التنمية إشارة. و <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC - bJunVN173</a> وpBiFC - bFosVC155 يبني 2 هي الضوابط الإيجابية مفيدة للBiFC وتتوفر من Addgene (انظر أعلاه). بالإضافة ، يجب إجراء تحليل لطخة غربية لتأكيد المساواة في التعبير يبني. وينبغي اختيار الأوضاع ويلاحظ ان هذه هي الملاحظة إشارة الفلورية بين نوعين من البروتينات الطبيعية ولكن القليل لعدم وجود إشارة بين نوع من البروتينات البرية ومتحولة. أخيرا ، فمن الأفضل للحفاظ على التعبير البروتين عند أدنى مستوى ممكن لمنع أي التفاعلات غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى ذلك تحديد ما إذا كان من شظايا BiFC يغير التعريب من البروتينات التي تهم كل بناء BiFC يحتوي إما على سطحه أو العلامة حاتمة FLAG. transefected Immunostain الخلايا HA على حد سواء أو FLAG علامة حاتمة فضلا جيدا للبروتين الذاتية (إن أمكن) لتحديد ما إذا كانت العلامة BiFC يؤثر توطين البروتينات المثيرة للاهتمام. </li></ol> وباء التصفيحات ترنسفكأيشن من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومطلي الخلايا COS (1.3x10 5) على كل كوب واحد أسفل لوحة ماتيك وبئرين لوحة 6 - جيدا لكل عينة. يسمح للخلايا لتسوية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ويمكن أيضا أنواع الخلايا التي هي بديل أكثر ملاءمة لمصلحة مرشح من بروتينات يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد السلطات الوطنية المعينة لترنسفكأيشن. نحن نستخدم عادة Lipofectamine (Invitrogen) لtransfections COS. ومع ذلك ، قد كواشف أخرى تكون أكثر ملائمة للخط الخلوي من الفائدة. منذ سيتم تقسيم الخليط ترنسفكأيشن بين كوب واحد الطبق السفلي وبئرين لوحة 6 - جيدا ، واستخدام كمية مناسبة من الحمض النووي لحساب هذا الانقسام. مخفف من الحمض النووي في 250uL DMEM المصل (SF) مجانا. إضافة CFP على مبلغ 1 / 5 من السلطات الوطنية المعينة BiFC مجموع كعنصر تحكم ترنسفكأيشن. لالكمي BiFC ، سيتم تحليل الخلايا فقط التي هي ايجابية للCFP عن وجود إشارة BiFC. علما بأن أطياف CFP سوف تتداخل مع بعض أزواج BiFC في الجدول رقم 1 ، وبالتالي عنصر تحكم ترنسفكأيشن البديلربما هناك حاجة. تمييع Lipofectamine في 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug من الحمض النووي). مزيج من الحمض النووي والتخفيفات Lipofectamine. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل20min. ملاحظة : Lipofectamine : نسبة الحمض النووي يمكن أن تختلف تبعا لنوع من الخلايا. استخدام الأسلوب المناسب لترنسفكأيشن خط خلية من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا 2X مع DMEM SF الدافئة. إضافة 2mL من DMEM SF إلى كل لوحة من الزجاج أو أسفل جيدا طبق 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم كل خليط ترنسفكأيشن بالتساوي بين كوب واحد الطبق السفلي وبئرين من صحن 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا عند درجة 37 ل5hrs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة واستبدال وسائل الاعلام ترنسفكأيشن الكامل مع وسائل الاعلام (FBS DMEM +10 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. سوف طول ترنسفكأيشن التالية الحضانة تختلف تبعا لمستويات التعبير من البروتينات المثيرة للاهتمام. حضانة لفترات طويلة قد يؤدي إلى التفاعل غير محددة حتى هذه الخطوة سوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. </li></ol> جيم إعداد خلايا للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم فحص الخلايا في البداية تحت المجهر epifluorescent لضمان السيطرة الإيجابية الفلورسنت. إذا لم يكن كذلك ، قد يكون من الضروري السماح للخلايا وقتا إضافيا عند 37 درجة مئوية حتى لاحظ إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). إلى الخلايا في وعاء زجاجي القاع إضافة بارافورمالدهيد 2 ٪ (7.4 درجة الحموضة). إصلاح الخلايا 10min على الجليد. شطف الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). تخزين الخلايا في 4 درجات مئوية مغطاة PBS 1mL (الرقم الهيدروجيني 7.4). الخلايا لا يجب أن تكون ثابتة للتصوير ، ولكن بمجرد شظايا BiFC بإصلاح fluorophore سليمة فإنه لا رجعة فيه تحليل وبالتالي منع التفاعلات الحيوية 3. أيضا ، أن نضع في الاعتبار أن الخلايا غير المثبتة سوف تستمر في تطوير الإشارة. ليز الخلايا في الطبق 6 - جيدا ، وأن يستعدوا للتحليل لطخة lysates الغربية. من المهم أن يتم إعداد كافة الخلايا في نفس الوقت بحيث الخلايا lysed تمثل الخلايا المصورة. </li></ol> دال خلايا التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسيتم احتساب كثافة مضان لكل خلية. تأكد من الخلايا صورة فردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدرج CFP كعنصر تحكم tranfection ويتم اختيار الخلايا CFP الإيجابية الوحيدة لتحليل الإشارات BiFC. يمكننا أن نجعل من افتراض أنه إذا transfected الخلية مع CFP ، هو transfected أيضا مع ثوابت BiFC. هذا النهج يضمن أن الخلايا التي تفتقر التقط اشارة BiFC سلبية نظرا لعدم وجود تفاعل بين البروتينات التي تهم وليس بسبب عدم وجود واحد أو كلا بنيات التعبير BiFC في تلك الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم LSM زايس مجهر 510 مبائر التصوير الخلية. عند استخدام هذا المجهر من المهم للحفاظ على التكبير ، والثقب ، واكتساب كاشف ، مكبر للصوت إزاحة ، حجم الإطار ، وسرعة المسح الضوئي ، ومتوسط ​​المسح الضوئي ، والليزر السلطة متناسقة. عند استخدام أي نظام التصوير من المهم للحفاظ على إعدادات ثابتة بحيث الاستشعاع للمقارنة بين العينات. أيضا ، عند قياس مضان من المهم أن لا يتم المشبعة بكسل. </li></ol> هاء تحديد مقدار الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد يكون كميا مضان باستخدام أي برنامج التصوير. نحن نستخدم ImageJ وهو متاح مجانا من المعاهد الوطنية للصحة (http://rsb.info.nih.gov/ij/). فتح ملفات الصور في ImageJ. انتقل إلى قياسات AnalyzeSet. خانات الاختيار للمنطقة ومتوسط ​​القيمة في مربع رمادي القياسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة "الاختيار اليد الحرة ، ورسم الخطوط العريضة حول حافة الخلية بأكملها في القناة CFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك هذا المخطط في المكان ، والتحول إلى القناة YFP. انتقل إلى AnalyzeMeasure. رمادي متوسط ​​القيمة هو مجموع القيم الرمادية من كل بكسل في اختيار مقسوما على عدد من بكسل (أي متوسط ​​كثافة مضان في مجال الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل صورة رسم دائرة في القناة YFP في المنطقة التي لا تحتوي على الخلية. أخذ القياس لهذه المنطقة الخلفية. طرح الخلفية من كل صورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​قيمة متوسط ​​رمادي ناقص الخلفية لكافة الخلايا المصورة في عينة واحدة. وسوف يكون هذا هو متوسط ​​كثافة مضان لسكان من الخلايا. نقترح أن يكون كميا حوالي 60 خلايا على مدى ثلاث تجارب. </li></ol> F. نتائج الممثل : مختبرنا يركز على البروتين السقالات متعددة المجال ، intersectin (ITSN) التي تتفاعل مع بروتينات عديدة لتنظيم متعددة المسارات البيوكيميائية ويشير 10،11،12،13،14. ITSN يحتوي على اثنين من تناظر Eps15 (EH) المجالات ، وهي منطقة ملفوف ، ملفوف ، وخمسة SRC تناظر 3 (SH3) المجالات. ويعد شكل الإسوي من ITSN يحتوي أيضا تناظر DBL (DH) وpleckstrin تناظر (PH) في المجالات التي تعمل كعامل الحفل تبادل النوكليوتيدات جوانين لCdc42 15. يعزز هذا الهيكل وحدات البروتين : بروتين تفاعلات ويجعل ITSN مرشحا مثاليا للتجارب BiFC. يمكن للتوطين التحت خلوية من ITSN تغيير شركائها ملزمة وبالتالي تغيير المسارات التي ينظمها ITSN (unpublisهد البيانات). مؤخرا ، أظهرت أن مختبرنا ITSN ينظم بقاء الخلايا العصبية من خلال تنظيم لPI3K رواية من الدرجة الثانية ، PI3K C2β - 11. الأمينية ، محطة برو الغنية مجال C2β - PI3K يحتوي على موقعين ملزمة للنطاقات SH3 ITSN ل. استخدام المشترك مع ITSN مناعي والمسوخ اقتطاع PI3K - C2β أثبتنا أن SH3A ITSN والتفاعل مع المجالات SH3C المنطقة الأميني من محطة C2β - PI3K. المقبل ، استخدمنا BiFC لتصور التعريب التحت خلوية من هذا المجمع. وتنصهر ITSN إلى محطة الأمينية فينوس (pFLAG - VN173) ، ويبني PI3K - C2β تنصهر في النهاية كربوكسي لكوكب الزهرة (PHA - VC155). كما تحكم آخر سلبي ، وتنصهر الببتيد غير محددة لPHA - VC155. شكلت VN - ITSN وVC - PI3K C2β - مجمع BiFC مع توزيع نقط (الشكل 2A ، لوحات العليا). انخفض الطفرات في المجال برو الغنية PI3K - C2β التي تعرقل التعاون ترسيب ITSN وPI3K C2β - إشارة BiFC (الشكل 2A ، وانخفاض لوحات) 11. وكان هذا الاختلاف في إشارة BiFC بين ITSN واثنين من البروتينات PI3K - C2β ليس بسبب الاختلافات في التعبير البروتين (الشكل 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> . الشكل 1 في BiFC ، يتم تقسيم fluorophore (في هذه الحالة فينوس) في الأمينية (VN) -- وكربوكسي (VC) ، تاريخ المحطة. وتنصهر هذه الغايات لاثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام. عندما تتفاعل البروتينين ، وشظايا وVN VC إعادة المنتسبين مما أدى إلى إعادة تشكيل fluorophore ومضان في مواقع التفاعل. BiFC هو مثال محدد للتكامل فحص البروتين شظية (PCA) يستخدم لقياس البروتين : البروتين التفاعلات 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. ITSN وPI3K - C2β تشكيل BiFC المعقدة. ألف VN - الموسومة كان ITSN المشترك tranfected مع VC - الموسومة WT - PI3K C3β أو مجال البرولين الغنية متحولة (PI3K - C2β والسلطة الفلسطينية). وشكل ITSN WT - PI3K C2β مجمع (الخضراء). وقد استخدم CFP (الحمراء) كعنصر تحكم ترنسفكأيشن باء أجري لطخة غربية لإظهار التعبير المتساوي للبنيات. والموسومة HA الرأسمالي الموسومة يبني. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="الجدول 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الجدول 1"> الجدول رقم 1 ، وهناك عدة ناقلات التي تتوافق مع BiFC. YN155 : 1 - 155aa من YFP ؛ YC155 : 155 238aa من YFP ؛ YN173 : 1 - 172aa من YFP ؛ YC173 ، 173 - 238aa من YFP ؛ VN155 : 1 - 154aa فينوس ؛ VC155 : فينوس 155-238 ؛ VN173 : 1 - 172aa فينوس ؛ VC173 : 173 238aa فينوس ؛ CN155 1 ​​- 154aa من CFP ؛ CC155 155 238aa من CFP ، GN173 : 1 - 172aa من GFP ، CitN155 : 1 - 155aa من سيترين ، CitC155 : 155 من 238aa السيترين ، CitN173 : 1 - 172aa من سيترين ، CitC173 : 173 238aa من سيترين ، CerN173 : 1 - 172aa للأزرق 2،3،9.

<ol><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li>
<li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+%28PCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li>
<li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis%2C+ubiquitylation%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li>
<li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3%27-kinase+C2beta-AKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li>
<li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving%5BTitle%5D)+AND+%22JNK.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li>
<li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+can+regulate+the+Ras%2FMAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li>
<li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis%2C+activates+mitogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li>
<li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenesis+and+endocytosis%3A+What%27s+at+the+INTERSECTIoN%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا كلها وتحديد توطين التحت خلوية من هذه المجمعات. مزايا BiFC فقط هي التي تتفاعل البروتينات هي الفلورسنت ، واستقرت تفاعلات عابرة ، وبعد معالجة البيانات التصوير هو الحد الأدنى. اثنين من مساوئ هذه الطريقة هي الوقت لنضوج fluorophore وعدم الرجوع عن fluorophore المعقدة. ويمكن وفقا لبعض التطبيقات يمكن استخدام هذا اللارجعة باعتبارها ميزة. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام انزيم ومنشط an هذا الانزيم في مجمع BiFC ، مما أدى إل...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>مصل جنين البقر</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>أطباق آبار دقيقة ذات قاعدة زجاجية</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>أطباق ذات 6 آبار</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>مجهر بؤري (كونفوكال)</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

Bimolecular Fluorescence Complementation

تحديد التوزيع التحت خلوية المجمعات إشارة لا بد من فهم أن الإخراج من التعقيد. الأساليب التقليدية مثل مناعي لا تقدم معلومات على توطين المكاني للمجمعات. في المقابل ، BiFC يراقب التفاعل والتقسيم التحت خلوية مجمعات البروتين. في هذه الطريقة ، يتم تقسيم البروتين fluororescent إلى أجزاء غير الفلورسنت الأمينية وكربوكسي المحطة ، التي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات المثيرة للاهتمام. تفاعل البروتينات النتائج في إعادة تشكيل fluorophore (الشكل 1) 1،2. وجود قيود على BiFC أنه بمجرد تشكيل لfluorophore تجزئة معقدة لا رجعة فيه 3. هذا القيد هو مفيد في الكشف عن التفاعلات عابرة أو ضعيفة ، ولكن ما يحول دون إجراء تحليل للديناميات الحركية المعقدة. تحذيرا إضافيا هو أن flourophore يتطلب إعادة 30min حتى تنضج ويتألق ، النافية مرة أخرى مراقبة التفاعلات الوقت الحقيقي 4. BiFC هو مثال محدد للتكامل فحص البروتين شظية (PCA) الذي يعمل مراسلا من البروتينات مثل بروتين الفلورية الخضراء المتغيرات (BiFC) ، dihydrofolate مختزلة ، ب اكتاماز ، وluciferase لقياس البروتين : البروتين 5،6 التفاعلات. طرق بديلة لدراسة البروتين : تفاعلات البروتين في الخلايا وتشمل الطاقة مضان بالرنين شارك في توطين ونقل فورستر (الحنق) 7. لتوطين المشترك ، والموسومة فردي اثنين من البروتينات إما مباشرة مع fluorophore المناعي أو غير مباشر. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يؤدي إلى خلفية عالية من البروتينات غير التفاعل مما يجعل من الصعب تفسير شارك في توطين البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للحدود قرار المجهري متحد البؤر ، قد تظهر اثنين من البروتينات المشترك المترجمة دون التفاعل بالضرورة. مع BiFC ، يلاحظ فقط مضان عندما اثنين من البروتينات الفائدة تفاعل. الحنق آخر هو طريقة ممتازة لدراسة البروتين : البروتين التفاعلات ، ولكن يمكن أن يكون تحديا تقنيا. الحنق التجارب تتطلب المانحة ومتقبل لتكون مماثلة من السطوع ورياضيات الكيمياء في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا بد من حساب واحد عن طريق التسييل من المانحين في القناة متقبل والعكس بالعكس. بخلاف الحنق ، BiFC ومضان الخلفية قليلا ، وبعد تجهيز البيانات القليل من الصور ، لا يتطلب overexpression عالية ، ويمكن الكشف عن التفاعلات الضعيفة أو عابرة. نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) هي طريقة مشابهة لالحنق باستثناء الجهة المانحة هو انزيم (مثل luciferase) الذي يحفز لتصبح ركيزة bioluminescent مثيرة مما يتسبب المتقبلة. بريت يفتقر المشاكل التقنية عن طريق التسييل ومضان خلفية عالية لكنه يفتقر الى القدرة على توفير المعلومات المكانية نظرا لعدم وجود ركيزة لتوطين المقصورات الخاصة 8. عموما ، BiFC هو وسيلة ممتازة لتصور التعريب التحت خلوية مجمعات البروتين لاكتساب نظرة ثاقبة يشير مجزأة.

توطين التحت خلوية من البروتينات مهم في تحديد لائحة المكانية والزمانية لمن إشارات الخلية. هنا ، نحن تصف تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) كوسيلة مباشرة لرصد التفاعلات المكانية من البروتينات في الخلية.

يعد تحديد التوزيع تحت الخلوي لمعقدات التأشير أمراً ضرورياً لفهم المخرجات الناتجة عن ذلك المعقد. إن الطرق التقليدية مثل...

تهدف هذه التجربة إلى تحديد ما إذا كان هناك تفاعل بين بروتينين داخل الخلايا، وتوضيح جوانب مواقع هذا التفاعل. أولاً، يتم نقل بنيات تعبيرية إلى الخلايا تشفر البروتينين المعنيين، بحيث يتم دمج أحدهما في الطرف النهائي لبروتين فلوري مجزأ، والآخر في الطرف C المكمل للبروتين الفلوري المجزأ. وبعد السماح للخلايا المنقولة بتطوير إشارة فلورية في المزرعة، يتم تصور المعقدات البروتينية عن طريق التصوير واللطخة المناعية.بعد ذلك، يتم تصدير الصور التي تم جمعها إلى برنامج تحليل صور مثل Image J من أجل قياس متوسط شدة الفلورة لكل خلية. في تجربة مضبوطة، يمكن لنتائج BIFC أن توضح التفاعلات بين البروتينات ومواقع تموضع هذه المعقدات، مثل تقاطع نطاقات SH three للبروتين السقالي ونطاق pro rich لبروتين PI three KC two beta. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التوضع المشترك (colocalization)، والترسيب المناعي (immunoprecipitation)، و FRET، في أن BFC تسمح بتحديد الموقع المكاني للتفاعلات العابرة الأضعف داخل الخلية. كما أن هذه الطريقة لا تتطلب معالجة مكثفة للصور بعد الالتقاط كما هو متبع في FRET.يمكن لهذه الطريقة معالجة أسئلة رئيسية في مجال نقل الإشارة، مثل ما إذا كانت البروتينات X و Y تتفاعل، وإذا كان الأمر كذلك، فما هي المقصورات المحددة التي تتمركز فيها هذه المعقدات داخل الخلية؟ وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في استخدام هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنهم لم يختاروا التكوين المناسب للتعبير عن خزعتهم. البروتينات الملحقة ذات الأهمية: ابدأ باختيار أحد الفلوروفورات المتعددة لبروتينات الاندماج BIFC.ضع في اعتبارك أن النهايات الطرفية الأمينية والكربوكسيلية لبروتين Venus قادرة على تشكيل معقد عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، بينما تتطلب شظايا Y-F-P-B-I-F-C تحضينًا مسبقًا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. صمم ناقلات تعبير لإضافة الوسوم إلى البروتينات المستهدفة من خلال دراسة مدى تأثير ربط شظايا BIFC على وظيفة البروتينات المستهدفة. على سبيل المثال، تخضع عائلة RAs، وبروتينات GTP a's لتعديل ليبيدي عند الطرف الكربوكسيلي، ولا يمكن وسمها عند هذه النهاية دون تعطيل هذا التعديل.قم دائمًا بإجراء تجارب استطلاعية لتحديد ظروف عفن transfection. كما يجب مراقبة الخلايا بواسطة المجهر الفلوري لتحديد الوقت الأمثل لظهور الإشارة. بعد ذلك، قم بإجراء تحليل western blossom للتأكد من التعبير المتساوي للنواتج الجينية (constructs).من المهم إجراء صبغ مناعي لوسم HA أو flag للتحقق من أن إضافة قطع BIFC لا تغير التموضع الخلوي للبروتينات المستهدفة في كل لوحة عينات. قم بتوزيع 1.3 × 10 من الخلايا الخمس في كل لوحة زجاجية القاع وبئرَيْن من لوحة ذات ستة آبار، واترك الخلايا تستقر طوال الليل في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C. في اليوم التالي، قم بتحضير حمض DNA لعملية عفن الخلية (transfection) باستخدام lipofection أو أي طريقة أخرى مفضلة.أولاً، قم بتخفيف الـ DNA في 250 µL من وسط DMEM الخالي من المصل ليكون بمثابة ضابط لعملية عفن الخلية (transfection control). أضف CFP بنسبة 1:50، وهي كمية إجمالي الـ BIFC DNAs المستخدمة. الآن قم بتخفيف الـ lip في 250 µL من وسط DMEM الخالي من المصل باستخدام 10 µL من الـ lip لكل 1 µg من الـ DNA.امزج مخففات DNA والليبوسومات ثم حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام وسط DMEM الدافئ الخالي من المصل. أضف 2 milliliters من وسط DMEM الخالي من المصل إلى كل طبق ذو قاعدة زجاجية أو بئر في طبق سداسي الآبار.بعد ذلك، وزع كل خليط ترانسفكشن بالتساوي بين طبق واحد ذو قاعدة زجاجية وبئرَيْن من طبق سداسي الآبار، ثم حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. وأخيراً، أزل وسط الترانسفكشن واستبدله بوسط DMEM كامل مضاف إليه 10% FBS.قم بتحضين الخلايا للمدة التي تم تحديدها في التجارب الاسترشادية للحصول على مستويات التعبير اللازمة للبروتينات المستهدفة. افحص الخلايا المنقولة جينياً باستخدام مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescent microscope) للتأكد من أن الضابط الموجب يظهر الفلورة. اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS من أجل تصوير الخلايا الحية.ضع الخلايا في وسط غذائي يخلو من صبغات المؤشر. ولتصوير الخلايا المثبتة، أضف 2% paraformaldehyde وضعها على الثلج لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم غطِّها بـ 1 mL من PBS واحفظها في الظلام عند درجة حرارة 4 °C، ثم قم بتحليل الخلايا في طبق الست فتحات فوراً. بالنسبة لتحليلات Western blot، من المهم تحضير جميع الخلايا في الوقت ذاته لضمان أن تكون الخلايا المحللة ممثلة للخلايا التي تم تصويرها. قم بإجراء Western blot للتأكد من تعبير البروتينات الموسومة بمستويات متكافئة.عند تصوير الخلايا باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope)، من المهم الحفاظ على ثبات الإعدادات طوال التجربة لضمان إمكانية مقارنة التألق بين العينات. تأكد من تصوير خلايا فردية بحيث لا تكون البكسلات مشبعة. وبما أن CFP قد أُدرج كعنصر تحكم في عملية عفن الخلايا (transfection control)، فاختر الخلايا الموجبة لـ CFP فقط لتحليل إشارات BIFC.قم بقياس الفلورة كمياً باستخدام برنامج تصوير مثل Image J. افتح ملفات الصور في برنامج Image J. انتقل إلى analyze ثم set measurements. حدد المربعات الخاصة بـ area و mean gray value في صندوق القياسات. لاحظ أنه في هذا المثال، تم تلوين الصور الوريدية باللون الأخضر الكاذب وصور CFP باللون الأحمر الكاذب.باستخدام أداة التحديد الحر، ارسم مخططاً حول حافة الخلية بأكملها في قناة CFP مع ترك هذا المخطط في مكانه. انتقل إلى قناة YFP. اذهب إلى قائمة "تحليل" (analyze)، وقم بقياس قيمة الرمادي المتوسطة التي تعكس متوسط شدة الفلورة لكل خلية في كل صورة.ارسم دائرة في قناة YFP في منطقة لا تحتوي على خلية. قم بأخذ قياس لهذه المنطقة كخلفية. اطرح قيمة الخلفية من كل صورة.وأخيرًا، لحساب متوسط شدة الفلورة لمجموعة من الخلايا، يتم حساب متوسط قيمة الدرجة المتوسطة مطروحًا منها الخلفية لجميع الخلايا التي تم تصويرها في عينة واحدة. ومن المثالي قياس 60 خلية عبر ثلاث تجارب. ينظم بروتين السقالة متعدد النطاقات intersecting بقاء الخلايا العصبية من خلال تنظيم فئة جديدة من PI three kinase class two، حيث تتفاعل نطاقات SH3 لبروتين PI3KC2β intersecting مع المنطقة الغنية بالبرولين في الطرف الأميني لبروتين PI3KC2β. ويؤدي ترصيص intersecting المسمى بـ VN مع PI3KC2β المسمى بـ VC إلى ظهور إشارة فلورية في قناة YFP، والتي يتم تلوينها اصطناعيًا باللون الأخضر للإشارة إلى تكوين المعقد.يُستخدم CFP الملون هنا باللون الأحمر كعنصر تحكم لتمييز الخلايا المنقولة؛ حيث تؤدي الطفرات في النطاق الغني بالبرولين لبروتين PI three KC two beta إلى تعطيل الترسيب المشترك لـ intersecting و PI three KC two beta، مما يقلل من إشارة BIFC. لا يعود هذا الاختلاف في إشارة BIFC إلى اختلافات في التعبير عن بروتينات PI three K من النوع البري و PA. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاثة أيام إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، يجب تذكر تشغيل عناصر التحكم المناسبة والتحقق من التعبير البروتيني لضمان أن الاختلافات في إشارة BC تعود إلى الاختلافات في تكوين المعقد وليس بسبب التعبير البروتيني المتبع في هذا الإجراء.يمكن إجراء تقنيات أخرى، مثل رنين البلازمون السطحي على المقيمين، للإجابة على أسئلة مثل: ما هي الألفات المختلفة لهذه المعقدات تجاه بعضها البعض؟

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذه المقالة يوضح كيفية استخدام صحيح BioRad هيليوس غون جين لإدخال الحمض النووي في الخلايا البلازميد البصل البشرة وكيفية اختبار للبروتين تفاعلات البروتين في الخلايا البصل على أساس مبدأ التكملة الإسفار ثنائي الجزيء...

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

قمنا بتطوير تقنية لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في المصنع. يتم تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة عن طريق نظام البوابة ، وتمكين التعبير عن البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق.

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

يصف هذا الفيديو BiFC-PALM - مزيج من الفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئيا واستكمال التألق ثنائي الجزيئات - لتقييم تفاعلات البروتين والبروتين. يتضمن BiFC اندماج جزأين من البروتين الفلوري مع اثنين من البروتينات المتفاعلة ذات الأهمية. عندما يتفاعل البروتينان ، يتم إحضار الشظايا على مقربة ، مما يسمح للجزأين بالالتقاء معا وإعادة تكوين بروتين فلوري وظيفي. يتم توطين تألق فلوروفور واحد على مستوى جزيء واحد داخل الخلايا بواسطة PALM.

الفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئي ثنائي الجزيئات المضان المقترن

في هذا الفيديو ، أظهرنا تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات ، BiCAP ، لاكتشاف وعزل ثنائيات بروتين معينة باستخدام الأجسام المضادة أحادية المجال الخاصة بالتشكل.

تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات لعزل بروتينين متفاعلين

تحليل تدفق cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء يوفر طريقة الكمية الإنتاجية العالية لدراسة التفاعل البروتين البروتين. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لرسم الخرائط مواقع الربط البروتين ولفحص العوامل التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

تشكيل مجمعات البروتين في الجسم الحي يمكن تصور من قبل ثنائي الجزيء تكامل مضان. وتنصهر شركاء التفاعل إلى أجزاء مكملة من العلامات الفلورية وأعرب عابر في أوراق التبغ، مما أدى إلى إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت على مقربة من البروتينات اثنين.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يتم تصور تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا ذات الدقة المكانية النانومترية من خلال الجمع بين تكميل التألق ثنائي الجزيئات (BiFC) والفحص المجهري للتوطين المنشط ضوئيا (PALM). الموصوف هنا هو استخدام BiFC-PALM لتصوير تفاعلات Ras-Raf في خلايا U2OS لتصور التجميع النانوي وانتشاره لمجمعات Ras-Raf الفردية.

Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)

ويصف هذه المخطوطة البروتوكول "تنقية تقارب التكامل بيموليكولار" (بيكاب). يسهل هذا الأسلوب رواية عزلة محددة وتوصيف البروتين المصب أي اثنين من البروتينات المتفاعلة، بينما استبعاد الأمم المتحدة الرصاصية البروتينات الفردية، فضلا عن مجمعات شكلت مع الشركاء ملزمة المتنافسة.

تشريح مجمعات البروتين متعدد الإشارات بالتكامل Bimolecular انجذاب تطهير (بيكاب)

ويصف هذا البروتوكول caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك)؛ أسلوب المستندة إلى التصوير التي يمكن استخدامها لتصور قرب المستحث للبادئ caspases، وهو الخطوة الأولى في تفعيل تلك.

تضيء سبل تفعيل Caspase استخدام التكامل Bimolecular Fluorescence

يوضح هذا البروتوكول استخدام فحص ربط القرب للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين في الموقع في خط ج. elegans الجرثومي.

في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في C. elegans Germline باستخدام القرب الربط اساي

هنا نقدم، طريقة لتصور تشكيل معقدة الترنية بين ثلاثة شركاء البروتين باستخدام البروتينات الموسومة الفلورسنت من قبل BiFC مقرها FRET-FLIM المقايسة. هذه الطريقة قيمة لدراسة مجمعات التفاعل البروتين البروتين في الجسم الحي.

تحديد التفاعل الثلاثي بين اثنين من مونومرات من عامل النسخ MADS مربع وبروتين استشعار الكالسيوم من قبل BiFC-FRET-FLIM المقايسة

اكتشف تقنية الإسفار التكاملي ثنائي الجزيء لدراسة تفاعلات البروتينات ومواقعها داخل الخلايا الحية. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تصوير التفاعلات الضعيفة والعابرة بدقة مكانية عالية.

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

استكشف المزيد من الفيديوهات