عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في E. القولونية

الهدف العام من الإجراء التالي هو استخدام بروتوكول فحص تعبير عالي الإنتاجية لتحديد مستوى البروتينات القابلة للذوبان في الإشريكية القولونية باستخدام روبوت آلي لمعالجة السوائل. يتم تحقيق ذلك عن طريق التلقيح الأول.96. حسنا ، الثقافات المسبقة مع الخلايا التي تحولت باستخدام البلازميدات التي تشفر بروتينات الاندماج المستهدفة في اليوم التالي ، يتم تلقيح 24 لوحة بئر مملوءة بوسائط الحث التلقائي بالثقافات المسبقة بين عشية وضحاها لتوليد التعبير.

يتم تنقية الثقافات بعد الحصاد وتجميد البروتينات القابلة للذوبان من ثقافات التعبير عن طريق كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة. في النهاية ، يمكن قياس مستويات الذوبان لكل اندماج مستهدف سليم لتحديد ظروف التعبير المثلى لإنتاج البروتين وتوليد الأهداف الناجحة. من مزايا هذه التقنية للطرق التقليدية لزيادة الكفاءة ، فإن الإشعاع المحدود من الدفعات إلى الدفعات وبساطة معالجة البيانات وتتبعها يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية.

قد تبدو الخطوات الآلية شاقة ويصعب فهمها في تنسيق النص وحده لأن النص لا ينقل سرعة أو بساطة الإجراء. بعد تحول البكتيريا ، تبدأ باستخدام القابض الآلي لوضع غطاء أول 24 بئرا من لوحة أجار LB. بعد ذلك ، استخدم ذراع مناولة السوائل ثماني القنوات لخلط ثم شفط 50 ميكرولترا من مزيج التحويل من لوحة تحويل 96 بئر.

قم بتوزيع مزيج التحويل داخل القنوات الأربع الأولى من ذراع مناولة السائل في العمود الأول من لوحة أجار LB والتحويلات داخل القنوات الأربع الأخيرة إلى العمود الثاني من لوحة أجار LB اغسل جميع الأطراف جيدا بعد الاستغناء عنها ثم استمر في نقل مزيج التحويل من لوحة البئر 96 إلى جميع الآبار في الأعمدة الأربعة التالية من لوحة أجار LB حتى تم الانتهاء من تلك اللوحة. بمجرد اكتمال النقل إلى اللوحة الأولى ، استبدل الغطاء وابدأ النقل للوحة التالية. بمجرد طلاء جميع التحولات ، قم بهز جميع الألواح لمدة دقيقة واحدة عند 1200 دورة في الدقيقة لإنشاء توزيع متجانس لمزيج التحويل.

ثم بعد الخلط ، استخدم الذراع متعدد القنوات 96 لشفط 60 ميكرولترا من مزيج التحويل المتبقي من لوحة البئر 96 وتوزيع المزيج في بئر عميق 96 لوح يحتوي على مرق LB. أغلق البئر العميق 96 مزرعة مسبقة بغشاء لاصق قابل للتنفس للسماح بتهوية الهواء المزروعة ، ثم ضع اللوحة في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية بأقصى سرعة بين عشية وضحاها. بمجرد أن تصبح الثقافات المسبقة في الحاضنة ، قم بقيادة ألواح أجار LB في غطاء مع إغلاق أغطيتها لمدة 10 دقائق تقريبا.

ثم اقلب الألواح في حاضنة صفيحة 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم ذراع مناولة السائل لشفط 100 ميكرولتر من الثقافة المسبقة بين عشية وضحاها في بئر عميق 96 صفيحة لتلقيح ثقافات التعبير عند تخفيف واحد 40 ، باستخدام نفس المخطط كما كان من قبل ، وغسل ذراع مناولة السائل جيدا في محطة الغسيل بين كل عمود من الثقافات المسبقة. عند الانتهاء من التلقيح ، ضع مزارع التعبير في حاضنة اهتزاز بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، مختومة بمادة لاصقة قابلة للتنفس لمدة أربع ساعات.

ثم اخفض درجة الحرارة إلى 17 درجة مئوية للحضانة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للبئر العميق 24 لوحا لمدة 10 دقائق عند 3000 Gs ، وتخلص من المادة الطافية في حاوية نفايات تحتوي على عامل مضاد للميكروبات ، ثم اضغط على الألواح رأسا على عقب على ورق ماص لإزالة أي وسط متبقي للتحقق من أن الثقافات قد نمت بشكل صحيح. تحقق من وجود الكريات في البئر العميق.

بعد ذلك ، قم بشفط 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، وقم بتوزيع المخزن المؤقت مرتين في كل بئر من البئر العميق 24 لوحا بأربع أطراف في كل بئر. للوصول إلى الحجم النهائي لمليلتر واحد من المخزن المؤقت للتحلل لإعادة تعليق الكريات ، قم بهز الألواح عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. على الروبوت ، انقل معلقات الخلية مرة أخرى إلى الآبار المناسبة للوحة بئر عميقة 96 وقم بتخزين الألواح محكمة الغلق عند سالب 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.

في هذا العرض التوضيحي ، سنستخدم البروتوكول مع 50 ميكرولترا من حبات النيكل لتنقية بروتينات الاندماج المستهدفة. قم أولا بإذابة لوحة البئر العميقة 96 في حمام مائي لمدة 15 دقيقة تقريبا. ثم يقوم التصلب بتعليق محللات الخلية في حاضنة الاهتزاز بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق إضافية ، يجب أن تصبح الثقافات لزجة.

بعد ذلك، استخدم ماصة يدوية من ثماني قنوات لتوزيع الحمض النووي وكبريتات المغنيسيوم في كل بئر من لوح البئر العميق 96 إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل مليلتر و20 ملليمولار على التوالي. رج الطبق المغلق لمدة 15 دقيقة أخرى وفي ذلك الوقت يجب أن تصبح الثقافة غير لزجة. لتجنب انسداد لوحة المرشح أثناء التنقية ، من الأهمية بمكان التحقق بعناية من عدم وجود أي من المحللات لزجة بعد الآن.

في روبوت مناولة السوائل ، استخدم أطراف تجويف بعرض 200 ميكرولتر لخلط ملاط الراتنج جيدا قبل نقل 200 ميكرولتر من الملاط إلى لوحة البئر العميقة 96 التي تحتوي على المحلل. رج لوحة البئر العميق 96 عند 1400 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بالربط ، ثم استخدم أطراف التجويف العريضة لخلط ثم نقل 1200 ميكرولتر كامل من ملاط محللة الراتنج في 200 ميكرولتر على لوحة المرشح. الآن قم بتشغيل المكنسة الكهربائية لمدة 30 ثانية تقريبا لتصفية المحللة من خلال اللوحة ، وجمع التدفق في بئر عميق.

96 أسفل البئر العميق 96 الذي يحتوي على التدفق من أسفل لوحة المرشح وتخزينه على رف حتى نهاية التجربة. ثم اغسل الراتنج مرتين باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم في كل مرة بعد الغسيل الثاني ، واستخدم القابض الآلي لوضع صفيحة 96 جديدة وعميقة وجيدة تحت لوحة الترشيح لجمع 50 ملليمولار I midaz wash. أضف 150 ميكرولترا من مخزن الغسيل المؤقت على لوحة الترشيح وقم بتطبيق المكنسة الكهربائية مرة أخرى حتى يمر المخزن المؤقت عبر البئر العميق 96 الذي يحتوي عليه.

تتم إزالة الغسيل من أسفل لوحة المرشح وتخزينه على رف حتى نهاية التجربة. ثم بعد الغسيل مرتين أخريين باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل كما هو موضح في المخزن المؤقت الملزم، استخدم القابض الآلي لنقل الصفيحة الدقيقة إلى طاولة العمل ووضع كتلة SPE ولوحة الترشيح مرة أخرى أعلى الصفيحة الدقيقة لجمع elucian. ثم أضف 190 ميكرولترا من المخزن المؤقت Elucian إلى الراتنج في لوحة المرشح.

بعد ثلاث دقائق ، ضع المكنسة الكهربائية لمدة دقيقة واحدة للسماح بمرور كل المخزن المؤقت. بسرعة ، تحقق بصريا من صحة المجلدات Ellucian. أخيرا ، قم بحظر عينات من غسل Ellucian وتدفقها عبر الألواح لقياس مستوى التعبير القابل للذوبان.

قم أولا بتحليل اللوحة الإليلوسية وفقط عند الضرورة ، تحقق من الغسيل والتدفق ذي الصلة من خلال الكسور. توضح هذه البيانات نتيجة الرحلان الكهربائي من نظام رقاقة مختبر الفرجار. يتم تمثيل بروتينات الاندماج المشقوقة السليمة من خلال النطاقات العلوية مع شظايا البروتين المشقوقة الممثلة على أنها النطاقات السفلية.

تم تحديد غلة الاندماج لكل بروتين مستهدف لتقع ضمن النطاقات من 0.1 إلى اثنين ، واثنين إلى 10 ، ومن 10 إلى 25 ميكروغرام لكل لتر من مستويات الثقافة ، أو في بعض الحالات لم يتم اكتشافها. يوضح تقييم نجاح تعبير البروتين من خلال عدد روابط كبريتيد diss الموجودة داخل كل جزء من بروتين الاندماج نجاحا معقولا لجميع أعداد روابط ثاني كبريتيد التي تم اختبارها مع أدنى مستوى نجاح هو 66٪ للأهداف التي تحتوي على ست روابط ثاني كبريتيد. يشير تحليل توزيع نجاح التعبير بناء على النقطة المتساوية وعدد المخلفات إلى عدم وجود تحيز معين للتقنية مع كل من الأهداف والأهداف التي لم يتم اكتشافها بنجاح منتشرة في جميع أنحاء المؤامرة.

بمجرد اكتشاف الاندماجات وشقها ، تخضع الأهداف المنقاة لمراقبة الجودة عن طريق تأين الرش الكهربائي ، وقياس الطيف الكتلي. هنا الهدف التمثيلي الموضح هو بروتين سم غني ب 5.7 كيلودالتون مع أربع روابط ثاني كبريتيد. يظهر هذا الطيف نتائج البروتين قبل الاختزال مع DTT كما كان بعد الانقسام والتحلية دون مزيد من التدخل.

يظهر هذا الطيف البروتين بعد التخفيض باستخدام DTT متبوعا بإزالة التحلية لإزالة أي DTT زائد. تشير الأسهم إلى الأيونات المقابلة للكتل التجريبية ويشار إلى تسمية كل أيون باللون الأخضر. تظهر الكتل الأصلية التجريبية المحسوبة لهذه الأيونات في الجدول وتتوافق مع فرق كتلة ثمانية دالتون ، أي ما يعادل أربع روابط كبريتيد يموت مؤكسد.

عند الإعداد ، يمكن تنفيذ البروتوكول الكامل على أكثر من ألف ثقافة في غضون أسبوع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مزارع الإشريكية القولونية صغيرة الحجم لتحديد الظروف الناجحة اللازمة لإنتاج البروتين القابل للذوبان باستخدام طرق عالية الإنتاجية.