ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

في عصر ما بعد الجينوم البشري، وتوافر البروتينات المؤتلف في التشكل الأصلية أمر حاسم لبحث الهيكلية والوظيفية والعلاجية والتنمية. هنا، نحن تصف تجارب واسعة النطاق نظام التعبير بروتين في الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى التي يمكن استخدامها لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات المؤتلف.

في هذا الفيديو ، نصف إجراء فعال من حيث الوقت والتكلفة للتعبير عن البروتينات المفرزة من خلايا Durant HEC 2 9 3 T المصنوعة من خلايا Durant HEC 2 9 3. في البداية ، يتم تحضير ثقافة خلايا HEC 2 9 3 T 40٪ في ستة أطباق عالمية. ثم يتم إنتاج خليط التعداء عن طريق تخفيف عصير الجينات ، ثم اختبار البلازميدات في وسط خال من المصل.

يتم ترسيب خليط التعدي على الخلايا ، والتي يتم احتضانها بعد ذلك عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير عن البروتين. يمكن إجراء الكشف عن البروتين في عامل سوبان بواسطة اللطخة الغربية. بمجرد تحديد بنية مناسبة ، يمكن توسيع نطاق الإجراء باستخدام مصانع خلايا من 10 طبقات.

يتم نقل الخلايا باستخدام PEI كتعداد. يمكن حصاد الكاشف والبروتين من المواد الطافية المزروعة باستخدام ترشيح التدفق العرضي متبوعا بكروماتوغرافيا التقارب. في النهاية ، تسمح هذه المنصة بالتعبير عن مجموعة واسعة من الجزيئات الكبيرة بكميات مليغرام.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التعبير عن خلايا الحشرات القائمة على فيروس البالو ، هي أنه يمكن فحص عدد كبير من التركيبات وتوسيع نطاقها للتعبير عنها مع الحصول على النتائج في غضون ثلاثة أسابيع. وسيكون عرض هذا الإجراء هو Hello Aiden لشادا زيني وجوناثان كوك. ثلاثة طلاب دراسات عليا من مختبري ابدأ ببذر 250،000 HEC 2 9 3 خلايا T لكل بئر بحجم واحد مليلتر واحد في صفيحة ستة آبار إضافة مليلتر واحد لكل بئر 10٪ FBS pentre مكمل DMEM و S قم بتدوير اللوحة لتفريق الخلايا بالتساوي.

ثم احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. بمجرد أن تصل الخلايا إلى طلاقة مشتركة تبلغ حوالي 40٪ ، استبدل SUP natum بملليلترين من الوسط الطازج لتحضير خليط التعداد. أول aliquot 90 ميكرولتر من مصل خالية من DMEM في أنبوب orph.

ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من عصير الجينات ، ويخلط كاشف التعداء محتويات الأنبوب برفق ويحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من 100 نانوجرام لكل ميكرولتر من البلازميد المنقى الإعدادي الصغير ، الحمض النووي. ليتم نقلها.

امزج محتويات الأنبوب واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لإجراء التعداء ، قم بإيداع الخليط على خلايا HEC 2 9 3 T. قطرة قطرة ، انتفخ الطبق برفق لتوزيع خليط التعداء بالتساوي.

ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، أضف ملليلتر واحد من الوسط الطازج إلى كل بئر واحتضنه لمدة 48 ساعة أخرى. بعد ثلاثة أيام من التعداء ، قم بحصاد السوبينات واكتشاف مستويات التعبير عن البروتين محل الاهتمام بواسطة اللطخة الغربية.

بمجرد تحديد التركيب المناسب ، يمكن توسيع نطاق إجراء التعدين. باستخدام مصانع الخلايا المكونة من 10 طبقات ، املأ مصنعا للخلايا ب 1.2 لتر DMEM مكملا بنسبة 5٪ FBS. ثم أضف 200 مليون خلية HEC 2 9 3 T ، وتوزيع الخلايا بالتساوي على جميع الطبقات.

تحتوي أربع قوارير لزراعة الخلايا T 225 سم مربع نمت إلى 100٪ من الطلاقة على حوالي 200 مليون خلية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تحضير خليط التعداء في قارورة T 75 عن طريق تخفيف 840 ميكروغرام من الحمض النووي في 84 مل من المعقمة مرة واحدة. برنامج تلفزيوني.

أضف 2.5 مل من ملليغرام واحد لكل مليلتر ، محلول أيون البولي إيثيلين أو PEI ، واحتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. يجب أن يصبح الحل غائما. بعد ذلك ، اسكب خليط التعداء ببطء في مصنع الخلايا ووزعه جيدا.

الطبقات الشاملة. أضف حمض الفالبرويك بتركيز نهائي قدره أربعة مللي مولار. سيؤدي ذلك إلى زيادة إنتاجية التعبير بمجرد إضافة خليط التعدين.

احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام للسماح بالتعبير عن البروتين. احصد الوسط بعد أربعة أيام من التعداء وقم بتنظيف مصنع الخلايا على الفور لإعادة استخدام جهاز الطرد المركزي للوسط الذي تم جمعه عند 6 ، 000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وقم بتصفيته من خلال جهاز تصفية فراغ الكوب الفراغي 0.22 ميكرون لإزالة أي جسيمات. ثم استخدم نظام ترشيح التدفق العرضي centra mate لتركيز المادة الطافية إلى 75 ملليلترا.

بمجرد تركيز المادة الطافية ، يمكن تنقية البروتين محل الاهتمام عن طريق كروماتوغرافيا التقارب. في هذه التجربة ، قمنا بتنقية الوحدات الفرعية المنفصلة HA لمجال مستقبلات AAL البشري خارج الخلية باستخدام النظام واسع النطاق الموصوف هنا ، متبوعا بكروماتوغرافيا مضادة ل THA عالية التقارب. كما هو موضح في تحليل صفحة SDS الملطخة ب kumasi.

تهاجر المجالات خارج الخلية للوحدتين الفرعيتين لمستقبلات الإنترلوكين ألفا وجاما بالأوزان الجزيئية البالغة 40 كيلودالتون و 46 كيلودالتون. تسبب عدم تجانس جليكان EnLink الموجود في IL two R alpha و IL two R gamma في توسيع النطاق على هلام صفحة SDS. يمثل نطاق الوزن الجزيئي الأعلى BSA الملوث.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتينات من زراعة الخلايا البشرية باستخدام مصانع خلايا من 10 طبقات. لا تنس أن خلايا HC 2 93 T تعتبر خطرة بيولوجيا ويجب التعامل معها في مستوى السلامة الحيوية الثاني. يرجى ارتداء ملابس الحماية الشخصية المناسبة دائما ، ويجب تطهير الأسطح وفقا للإرشادات المؤسسية والحكومية.