كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

الهدف العام من تقنية التعبير عن بروتين الثدييات هذه هو إنتاج كميات مليغرام من البروتينات المطوية أصلا المناسبة للدراسات الهيكلية والفيزيائية الحيوية والوظيفية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بروتوكول سريع ومباشر للحصول على بروتينات الثدييات المفرزة وتركيز في النقاء المطلوب للدراسات الهيكلية. بشكل عام ، نجد أن معظم المشكلات المتعلقة بإنتاج البروتين ترجع إلى صحة الخلية وقابليتها للحياة.

من خلال مراقبة بقاء الخلية عن كثب ومراقبة مستويات السكر في الوسائط ، فإنك تحسن بشكل كبير من إنتاج البروتين وتطيل فائدة الخلايا. من المهم أيضا مراقبة كثافة الخلايا. نجد أنه إذا تجاوزت الخلايا في أي وقت قبل التعدي 2 مليون خلية لكل مليلتر ، فإن إنتاج البروتين ينخفض بشكل كبير لإجراء استزراع واسع النطاق ل 2 93 F خلية تكمل لترا واحدا من 2 93 F وسائط مع 10 ملليلتر من 100 × الجلوتامين وخمسة ملليلتر من 100 × بكتيريا القلم.

يكون المضاد الحيوي بقوة كافية في الظروف الخالية من المصل ويحسن تركيز المضادات الحيوية المنخفض من بقاء الخلية أثناء التعدي ، مما يحسن مزرعة إنتاج البروتين. 2 93 F الخلايا في 300 مل من الوسائط في لتر واحد ، قوارير إرلينماير محيرة من البولي كربونات مع أغطية تهوية عند 37 درجة مئوية مع 8٪ ثاني أكسيد الكربون أثناء الاهتزاز في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية قبل يوم واحد من التعدي تمييع الخلايا إلى 0.5 مليون خلية لكل كثافة مليلتر في يوم التعدين. استكمل وسط الاستزراع بإضافة 10٪ حجم من 2٪ وزن لكل حجم للخلية في 2 93 درجة فهرنهايت الوسائط.

أضف كافو في رأينا في هذه الخطوة للتحكم في الارتباط بالجليكوزيل البروتين. تحضير محاليل الحمض النووي وكشف التعداء في الوسائط الخالية من المصل لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف كاشف التعدي إلى محلول الحمض النووي بزيادات مليلتر واحدة من الخلط.

احتضن برفق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تتشكل مجمعات الحمض النووي الكاشف. ثم أضف المحلول إلى الخلايا بطريقة متدلية ، اسمح للخلايا المنقولة بالتعبير عن البروتين لمدة 72 إلى 96 ساعة لتنقية البروتين السكري. قم أولا بصب المزرعة في جهاز طرد مركزي قارورة طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند الساعة 1300 Gs.To حبيبات الخلايا ، وجمع الطابر ، وإذا لزم الأمر ، قم بالدوران مرة ثانية و / أو استخدم مرشح 0.22 ميكرون لتوضيح المادة الطافية.

بعد ذلك ، أضف 10٪ من حجم 10 × حمولة نيترو النيكل أو حمض الخليك الثلاثي أو المخزن المؤقت الملزمة NTA من النيكل. ثم قم بإعداد عمود جاذبية عند أربع درجات مئوية عن طريق إضافة ملليلترين من ملاط النيكل NTA إلى عمود والتوازن مع 10 أحجام أعمدة من مخزن مؤقت ملزم واحد x يعمل عند أربع درجات مئوية. قم بتدفق المادة الطافية فوق الراتنج وجمع التدفق من خلال.

بعد صب تدفق المادة الطافية فوق العمود ، اغسل ب 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للغسيل. ثم قم بتصفية البروتين في خمسة أعمدة من المخزن المؤقت للشطف. إذا كان نزع الجليسات مطلوبا لحجم نهائي قدره 0.5 ملليلتر ، فقم بتركيز EIT إلى 0.43 مل باستخدام حبيبات مكثف الطرد المركزي أي حطام بالطرد المركزي عند 16 ، 000 GS وأربع درجات مئوية.

ثم أضف 50 ميكرولترا من سترات الصوديوم 500 مللي مولار ، ودرجة الحموضة 5.5 و 20 ميكرولتر من endo hf. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين لإزالة endo HF أولا اغسل راتنج الأميليوز ثلاث مرات في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. احتضان البروتين بالراتنج المغسول لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية.

بعد الحضانة ، قم بالدوران لمدة خمس دقائق عند 1000 Gs لتكوير الراتنج وجمع المادة الطافية. قم بتركيز البروتين باستخدام قطع الوزن الجزيئي المناسب ، ومرشح الطرد المركزي ، وتبادل المخزن المؤقت في مخزن التخزين الموضح. فيما يلي نتائج صفحة SDS التمثيلية لبروتين مفرز يتم التعبير عنه في الخلايا المعالجة السينمائية بعد كروماتوغرافيا تقارب النيكل.

الممر الأول هو البروتين قبل إزالة السكر من السكر ، والممر الثاني هو البروتين الذي يتبع إزالة الجليكوزيل بواسطة endo hf. يمتد البروتين الغليكوزيلاتي بحوالي 10 كيلو دلتون أعلى ثم ينهار إلى نطاق واحد يتوافق مع الوزن الجزيئي المتوقع بعد إزالة السكر من السكر ، بعد خطوة التنقية الفردية. تم إعداد شاشات كريستال باستخدام طريقة الإسقاط المعلقة.

تظهر الصورة العلوية الضربة البلورية الأولية وتظهر الصورة السفلية ظروف التبلور المحسنة. يوضح هذا أن التجانس الكيميائي الحيوي للبروتين المعني يمكن أن يكون عاملا حاسما لنجاح التبلور ، وينتج نظام التعبير المحسن للثدييات بروتينات قابلة لهذا التبلور. يتم إجراء مزيد من تنقية البروتين المنقى بالنيكل بسهولة عن طريق الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم.

هذه أيضا خطوة مفيدة نحو تقييم إنتاج البروتين وتحسين الظروف لإنتاج بروتينات مطوية بشكل صحيح. يجب أن يكون البروتين محل الاهتمام هو النوع الرئيسي في الشطف الكروماتوجرافي ، ويجب أن يتوافق حجم الشطف مع الوزن الجزيئي للبروتين. أسبق. قد تشير أوقات EEU إلى تجميع البروتين أو طيه بشكل خاطئ بمجرد إتقانه.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على ظروف معقمة لزراعة الخلايا باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الحجم ، وكروماتوغرافيا الاستبعاد ، وتشتت الضوء متعدد الزوايا والمسح التفاضلي ، والقياس الفلوري من أجل تقييم حالة الأولياء والاستقرار الحراري للبروتين.