يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في مراقبة دور الإجهاد الميكانيكي على الميكانيكا الحيوية الخلوية في وقت يقارب الوقت الحقيقي. ويتحقق ذلك أولاً من خلال بناء نظام يحتوي على أغشية مرنة تُزرع عليها الخلايا ويتم تمديدها. وكخطوة ثانية، يتم تمديد الغشاء لمعايرة عدد دورات المحرك مع إجهاد الغشاء.

بعد ذلك، يتم تمديد الخلايا الطلائية لرئة الفأر وتصوير النوى. ولإثبات انتقال إجهاد الغشاء إلى الخلايا، دُمجت أجهزة التمديد لاحقاً في مجهر القوة الذرية (AFM) لإجراء التثليت النانوي (nano indentation) بهدف قياس صلابة الخلايا الفردية قبل التمديد وبعده. وتظهر النتائج حدوث ضرر مباشر في الخلايا نتيجة التمديد المطبق.

وبناءً على التصوير الفلوري أيضاً، تظهر النتائج أن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية يزداد مع التمدد. ويمكن لهذه الطريقة أن تجيب على أسئلة جوهرية في مجال البيولوجيا الميكانيكية للرئة، مثل ما إذا كانت الخلايا الظهارية قد تتعرض للإصابة بسبب التهوية الميكانيكية أم لا. كما يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول البيولوجيا الميكانيكية لخلايا الرئة، ويمكن تطبيقها أيضاً على أنسجة رخوة أخرى مثل شرائح الكبد أو شرائح صفيحة النمو.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب المزيج غير التقليدي من الأدوات المستخدمة في هذه التجارب، مثل المجهر القوة الذرية. للبدء، قم بتجهيز غشاء PDMS مطلي بالكولاجين ومعدل للاستخدام في زراعة الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب. بعد ذلك، قم باستزراع خلايا طلائية رئوية من الفئران بكثافة 2.5 million cells لكل بئر على غشاء مرن ومعقم مطلي بالكولاجين.

تُحضن الخلايا عند 37 درجة Celsius و5%CO2 لمدة يومين حتى تصل الخلايا إلى مرحلة الاندماج الكامل (confluency). بعد ذلك، تُستخدم خرامة خزعة بقطر 1.5 millimeter لعمل ثقبين في كل من لسانات التثبيت الست، على بُعد 20.5 millimeter من مركز البنية في حال عدم الرغبة في تطبيق شد مسبق. ثم يتم إزالة وسط زراعة الخلايا.

تأكد من أن المشغل الميكانيكي في وضع انفعال صفري، وضع الغشاء على جهاز التمديد بحيث تتماشى ثقوب التثقيب مع الدبابيس والمشابك. ثبّت المشابك العلوية في مكانها، ثم أحكم ربط البراغي واحدًا تلو الآخر، بالتناوب بين الجوانب المختلفة. أضف 1 mL من وسط زراعة الخلايا قبل وضع الجهاز على منصة المجهر.

قم بتوسيط الجهاز على مسار الضوء. بعد ذلك، ثبت الجهاز على المنصة. قم بتركيز الرؤية على الغشاء عن طريق ضبط الموضع الأفقي والرأسي للجهاز الميكانيكي باستخدام وحدة التحكم في منصة المجهر الموجودة في كتلة الإدخال المحددة.

أدخل قيمة عدد دورات المحرك، والتي تقابل مستوى الإجهاد المطلوب تطبيقه. بعد ذلك، اضبط القيمة في كتلة إدخال السرعة على 10 RPM أو أقل لمراقبة نفس المجال قبل وبعد التمدد، حيث قد ينزاح المجال بالنسبة لعدسة المجهر الشيئية، وقد يكون من الضروري ضبط منصة المجهر أثناء التمدد. وبمجرد ضبط كل شيء، انقر على "go".

ابدأ بإجراء التعديلات على مجهر القوة الذرية. قم بزيادة ارتفاع رأس الـ FM إلى أقصى موضع له في اتجاه Z. ثم ضع وصلات تمديد على الأرجل لرفع المستوى الذي يتلامس فيه ذراع الـ FM مع العينة.

بعد ذلك، قم بإزالة لوحة ماسح A FM والعدسة الشيئية المطلوبة من المجهر. أضف فاصلًا إلى العدسة الشيئية ثم أعد تركيبها على المجهر. بعد ذلك، ضع لوحة الماسح مرة أخرى على A FM. سيعتمد ارتفاع الفاصل على العدسة الشيئية وإعداد A FM المحدد، ولكن من الضروري استخدام الفاصل إذا كان التصوير البصري مطلوبًا لأن مستوى الرصد سيزاح في اتجاه Z.

بعد ذلك، قم بتشغيل برنامج A FM، وبرنامج المجهر الضوئي، وجميع مصادر الضوء اللازمة، بما في ذلك مصدر الضوء الخاص بقياسات الفلورة. ثبّت شريحة تحتوي على شعاع ناتئ (cantilever beam) تبلغ صلابته 200 pico newtons per nanometers أو أقل لقياس معامل المرونة للخلايا الحية باستخدام A FM. ثم قم بمحاذاة الليزر، بعد ذلك ثبّت شريحة غطاء زجاجية على الجهاز واستخدمها لمعايرة صلابة الشعاع الناتئ وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. وقبل تثبيت الغشاء على جهاز الشد مباشرةً، قم بقص الجدران ليصل ارتفاعها إلى حوالي one millimeter.

يقلل هذا من التداخل الحاصل بين جدران الغشاء وخلية التحميل. بعد ذلك، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا وثبّت الغشاء على الجهاز الميكانيكي. ضع الجهاز الميكانيكي مع المهايئ على الماسح الضوئي باستخدام البرنامج.

قم بتمديد الغشاء إلى مستوى انفعال الشد المطلوب قبل إجراء عملية النانو-إزاحة (nano indentation). أضف 0.5 milliliters أو أقل من الوسط الغذائي فوق الخلايا للحفاظ على ترطيبها، مع الحرص على تجنب أي انسكاب قد يؤدي إلى تلف ماسح FM أو المجهر. بعد ذلك، قم بملامسة عارضة الكابول (cantilever beam) للغشاء.

اتبع البروتوكول الخاص بجهاز AFM المحدد لمسح المناطق ذات الأهمية. عندما تم تطبيق انفعال بنسبة 20% على الخلايا المزروعة على الغشاء، أزِيحت الخلايا بنسبة 20% كما هو موضح هنا، وتم قياس تأثير الخلايا على إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الظهارية الشعبية باستخدام مستشعر تراكمي للسوبر أكسيد الميتوكوندريا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. وفي غياب التمدد الميكانيكي، لم يزد إنتاج ROS بشكل ملحوظ على مدار 60 دقيقة عند تطبيق تمدد واحد بنسبة 17% والحفاظ عليه.

حدثت زيادة في أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الميتوكوندريا والتي استمرت لمدة 60 دقيقة أخرى مع دمج جهاز التمدد الميكانيكي في مجهر القوة الذرية. تم الحصول على معامل المرونة وخرائط الخلايا الظهارية لرئة الفأر قبل وبعد تعرضها لإجهاد شد بنسبة 10% من المناطق المحددة هنا. تم تسجيل 300 منحنى انحراف قسري فردي على مساحة 40 في 40 ميكرومتر، مما أظهر تغيراً في تموضع مناطق المعامل المرتفع عند تطبيق الإجهاد.

بمجرد إتقان عملية تمديد الخلايا، يمكن إنجازها في غضون 15 دقيقة. وفي حين أن عملية التثليم النانوي باستخدام مجهر القوة الذرية (FM) قد تستغرق ساعتين من التنفيذ الدقيق، فمن المهم عند محاولة تطبيق هذا الإجراء تذكر التعامل مع الخلايا بعناية وسرعة في آن واحد، حيث يمكن أن تتأثر النتائج سلباً بالهز أو بالتعرض المطول لهواء الغرفة قبل تسجيل البيانات. ولا تنسَ أن العمل باستخدام مجهر القوة الذرية (FM) قد يكون تحدياً كبيراً.

يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء، مثل إبقاء جميع السوائل بعيداً عن الماسح الضوئي.