يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة دور الإجهاد الميكانيكي على البيولوجيا الميكانيكية للخلية في الوقت الفعلي تقريبا. يتم تحقيق ذلك من خلال بناء نظام بأغشية مرنة تنمو عليها الخلايا وتمتد. كخطوة ثانية ، قم بتمديد الغشاء لمعايرة عدد المحركات بإجهاد الغشاء.

بعد ذلك ، يتم شد الخلايا الظهارية لرئة الفأر وتصوير النوى. من أجل إظهار أن سلالة الغشاء تنتقل إلى الخلايا ، يتم دمج النقالات بعد ذلك في A FM للمسافة البادئة النانوية من أجل قياس صلابة الخلايا الفردية قبل التمدد وبعده. تظهر النتائج أضرارا مباشرة على الخلايا بسبب التمدد المطبق.

بناء على التصوير الفلوري أيضا ، يظهر أن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية يزداد مع التمدد. حسنا ، يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الميكانيكية للرئة ، مثل ما إذا كان يمكن إصابة الخلايا الظهارية بالتهوية الميكانيكية أم لا. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لخلايا الرئة والبيولوجيا الميكانيكية ويمكن أيضا تطبيقها على الأنسجة الرخوة الأخرى مثل شرائح الكبد أو لوحة النمو.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب المزيج غير التقليدي من الأدوات المستخدمة في هذه التجارب مثل مجهر القوة الذرية. للبدء ، قم بإعداد غشاء PDMS مطلي بالكولاجين معدل للاستخدام في زراعة الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، الخلايا الظهارية لرئة الفأر بذرة 2.5 مليون خلية لكل بئر على غشاء مطلي بالكولاجين معقم ومرن.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة يومين حتى تصل الخلايا إلى الطلاقة. ثم استخدم لكمة خزعة 1.5 ملم لعمل ثقبين في كل من علامات تبويب المشبك الست ، على بعد 20.5 ملم من مركز البناء إذا لم يكن هناك رغبة في الادعاء. وإزالة وسائط زراعة الخلايا.

تأكد من أن المشغل الميكانيكي في وضع عدم الإجهاد ، ووضع الغشاء على نقالة بحيث تتماشى فتحات الثقب مع المسامير والمشابك. ضع المشابك العلوية في مكانها ، ثم اربط البراغي واحدة تلو الأخرى ، بالتناوب بين الجوانب المختلفة. أضف وسائط زراعة خلية واحدة من المليلتر قبل وضع الجهاز على مرحلة المجهر.

ضع الجهاز في توسيط على مسار الضوء. بعد ذلك ، قم بإصلاح الجهاز على المسرح. ركز على الغشاء عن طريق ضبط المواضع المستوية والرأسية للجهاز الميكانيكي باستخدام وحدة تحكم في المسرح في المجهر في كتلة إدخال الوجهة.

أدخل قيمة عدد المحركات ، والتي تتوافق مع مستوى الإجهاد المطلوب ليتم تطبيقه. بعد ذلك ، اضبط القيمة في كتلة إدخال السرعة على 10 دورة في الدقيقة أو أقل لمراقبة نفس المجال قبل وبعد التمدد حيث قد يتحول الحقل فيما يتعلق بهدف المجهر ، وقد يكون من الضروري ضبط مرحلة المجهر أثناء التمدد. بمجرد ضبط كل شيء ، انقر فوق go.

ابدأ بإجراء تعديلات على مجهر القوة الذرية. قم بزيادة ارتفاع رأس FM إلى أقصى موضع له في الاتجاه Z. ثم ضع موسعات على الساقين لرفع الطائرة التي يتصل عندها ناتئ FM بالعينة.

بعد ذلك ، قم بإزالة لوحة الماسح الضوئي A FM والهدف المطلوب من المجهر. أضف فاصلا إلى الهدف ثم قم بتثبيته مرة أخرى على المجهر. ثم ضع لوحة الماسحة الضوئية مرة أخرى على A FM. يعتمد ارتفاع الفاصل على الهدف وإعداد FM المحدد ، ولكن من الضروري استخدام الفاصل إذا كان التصوير البصري مطلوبا حيث سيتم تحويل خطة المراقبة في الاتجاه Z.

بعد ذلك ، ابدأ تشغيل برنامج A FM وبرنامج المجهر البصري وجميع مصادر الضوء اللازمة ، بما في ذلك مصدر الضوء لقياسات التألق. قم بتركيب شريحة بشعاع ناتئ بصلابة تبلغ 200 بيكو نيوتن لكل نانومتر أو أقل لقياس معامل المرونة للخلايا الحية على A FM. ثم قم بمحاذاة الليزر بعد ذلك ، وقم بتركيب غطاء زجاجي على الجهاز واستخدمه لمعايرة صلابة الكابولي وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة. مباشرة قبل تركيب الغشاء على جهاز التمدد ، قم بقطع الجدران إلى حوالي ملليمتر واحد في الارتفاع.

هذا يقلل من التداخل بين جدران الغشاء وخلية الحمل. ثم قم بإزالة وسائط زراعة الخلية وقم بتركيب الغشاء على الجهاز الميكانيكي. ضع الجهاز الميكانيكي مع المحول على الماسحة الضوئية باستخدام البرنامج.

قم بتمديد الغشاء إلى مستوى إجهاد الشد المطلوب قبل المسافة البادئة النانوية. أضف 0.5 مل أو أقل من الوسائط إلى الخلايا للحفاظ على رطوبتها ، ولكن احرص أيضا على تجنب الانسكاب الذي قد يؤدي إلى تلف ماسح FM أو المجهر. ثم قم بإشراك شعاع الكابولي بالغشاء.

اتبع بروتوكول جهاز A FM المعين لمسح مناطق الاهتمام. عندما تم تطبيق سلالة 20٪ على الخلايا المزروعة على الغشاء ، أزاحت الخلايا 20٪ كما هو موضح هنا ، تم قياس تأثير الخلايا على إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الظهارية القصبية باستخدام مستشعر فائق أكسيد الميتوكوندريا التراكمي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. في حالة عدم وجود تمدد ميكانيكي ، لم يزداد إنتاج ROS بشكل كبير خلال 60 دقيقة عند تطبيق امتداد واحد بنسبة 17٪ والحفاظ عليه.

كانت هناك زيادة في ROS للميتوكوندريا استمرت لمدة 60 دقيقة أخرى مع دمج النقالة الميكانيكية في مجهر القوة الذرية. تم الحصول على معامل المرونة وخرائط الخلايا الظهارية لرئة الفأر قبل وبعد سلالة الشد بنسبة 10٪ من المناطق الموضحة هنا. تم تسجيل 300 منحنى انحراف قسري فردي على مساحة 40 × 40 ميكرومتر مما يدل على تغيير في توطين مناطق المعامل العالي مع تطبيق الإجهاد.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تمدد الخلايا في 15 دقيقة. في حين أن المسافة البادئة FM nano قد تستهلك ساعتين من الأداء بشكل صحيح أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع الخلايا بعناية وبسرعة حيث قد تتأثر النتائج سلبا بالتحريض والتعرض لفترات طويلة لهواء الغرفة قبل الإبلاغ عن البيانات. لا تنس أن العمل مع FM يمكن أن يكون صعبا للغاية.

يجب اتخاذ الاحتياطات مثل إبعاد جميع السوائل عن الماسح الضوئي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.