التعبير عابرة من البروتينات عن طريق هيدرودينامي الجينات في الفئران التسليم

الهدف العام من هذا الإجراء هو التعبير العابر عن الجينات في الفئران باستخدام توصيل الجينات الهيدروديناميكية أو HGD للقيام بذلك. يتم وزن الفئران وكمية مناسبة من المحلول الملحي الذي يحتوي على البلازميد. يتم تحضير الحمض النووي وتحميله في حقنة.

ثم يتم تسخين الفأر لتوسيع الأوعية الدموية في الذيل ووضعه في مصفاة باستخدام الشريان الظهري. كمرجع ، توجد الأوردة الجانبية وحقن مزيج الحمض النووي الملحي في أحد الأوردة المهدلة. أخيرا ، تتم إزالة الماوس من المصفاة ووضعه على حصيرة دافئة للتعافي.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تعبيرات الجينات المعدلة من خلال مراقبة مستويات البروتين في الدم بواسطة اللطخة الغربية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة ، مثل التعبير عن نقل الدم الفيروسي ، هي أن توصيل الجينات الهيدروديناميكية يسمح باستخدام الحمض النووي المنقوش العاري ، وهو سهل الإنتاج وآمن للاستخدام وله قيود أقل على الحجم. أنا دانييلا كوفاسيتش.

أنا باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتورة جين رابر ، وسأعرض هذه الطريقة. ابدأ هذا الإجراء باستخدام Sharpie لتمييز ظهور الفئران البيضاء للإشارة إلى مجموعتهم التجريبية التي تعيد وضع العلامات بمرور الوقت حسب الضرورة. في يوم التجربة ، قم بوزن كل فأر على حدة في وعاء وزن حيواني أو دلو موضوعة على ميزان مختبر رقمي.

سجل وزن كل ماوس باتباع الإرشادات الواردة في المستند المرفق. قم بإعداد مزيج حقن كاف لكل فأر ليتم حقنه ، بالإضافة إلى مزيج واحد لأن التحميل المناسب للمحاقن سيتطلب بعض مزيج الحقن الإضافي. استخدم محلول ملحي معقم خال من السموم الحافظة والمعتمد للاستخدام البشري.

بعد السماح لجميع المحاليل بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتوصيل إبرة معقمة قياس 20 بحقنة قفل سفلي سعة ثلاثة ملليلتر وشفط مزيج الحمض النووي الملحي x. قم بإعداد حقنة واحدة لكل حقنة. تأكد من عدم توليد أي فقاعات هواء.

تجنب استخدام المحاقن ذات الحجم الأكبر حيث لا يمكن التحكم في فلورايد الحقن بشكل جيد للغاية ومن الصعب التلاعب بالمحاقن الكبيرة في يد واحدة. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى إبرة معقمة قياس 27. اضبط حجم مزيج الحمض النووي الملحي كما هو محسوب.

إخراج أي محلول زائد مرة أخرى في الأنبوب المخروطي لاستخدامه لاحقا. هذا سوف يملأ الإبرة. دون إدخال فقاعات الهواء.

لا تسمح للإبرة غير المغطى بلمس أي سطح غير معقم لحماية الإبرة قبل الحقن. تلخيصها باستخدام تقنية بيد واحدة. ضع الغطاء على سطح مستو ثم دون الإمساك بالغطاء باليد الأخرى ، أدخل الإبرة واضغط على الإبرة المغطاة بجسم صلب.

لتأمين الغطاء ، قم بإعداد جميع المحاقن المطلوبة بنفس الطريقة. أدخل قبل بدء الحقن. ضع قفص الفأر مع الفراش المتضمن على وسادة حرارة لمدة خمس دقائق بحيث تكون درجة حرارة الفراش حوالي 38 إلى 39 درجة مئوية.

سيؤدي ذلك إلى توسيع الأوعية الدموية للفئران. لاحظ أنه لا ينصح بالتخدير لهذا الإجراء أثناء ارتفاع درجة حرارة الفئران ، استخدم شريط المختبر لتثبيت مقيد الوصول الظهري على سطح مستو. بعد مرور خمس دقائق ، تم فك غطاء المحقنة لاستخدامها في حقن الفأر الأول.

ضع المحقنة على الغطاء لمنع الإبرة غير المغطى من لمس الأسطح غير النظيفة. لكل من السلامة والنظافة. احتفظ بإبرة واحدة غير مغطاة في كل مرة.

بعد ذلك ، التقط الفأر من الذيل. ضعه برفق في الأداة وأدخل القابس. استخدم أقل قدر ممكن من ضبط النفس لإبقاء الذيل ثابتا.

تأكد من أن الماوس يتنفس بحرية. بعد ذلك ، حدد موقع الأوردة الجانبية من خلال النظر مباشرة إلى الجزء الخلفي من الفأر. الخط الأحمر الذي يمتد في منتصف الذيل هو شريان.

في حين أن الخطوط الزرقاء على جانبي الذيل هي الأوردة الجانبية ، ضع الفأر ، بحيث يكون أحد الأوردة الجانبية مرئيا. ثم امسح ذيل الماوس جيدا بمسحة كحولية. باستخدام اليد غير القابلة للحقن ، أمسك الذيل بإحكام بين السبابة والأصابع الوسطى بحيث يمر الذيل تحت السبابة فوق الإصبعين الأوسط والثالث وتحت الإصبع الصغير.

اسمح للإبهام بالبقاء حرا في الحركة. باستخدام اليد الأخرى ، استخدم مسحة كحولية لمسح منطقة الحقن. مرة أخرى ، اترك المنطقة تجف.

الآن باستخدام يد الحقن ، التقط المحقنة المحملة وامسكها من البرميل بين الإبهام والأرقام الأربعة الأخرى. لا تمسك بالمكبس. ضع المحقنة موازية للذيل مع توجيه الإبرة نحو جسم الماوس والحافة المخروطية أو المائلة للإبرة متجهة لأعلى.

أدخل الإبرة في الوريد الذيل. إذا تم تحديد موقع الوريد بشكل صحيح ، فسوف تنزلق الإبرة دون مقاومة أثناء تثبيت الإبرة ، واستخدم إبهام الذيل الذي يمسك باليد لإغلاق محور الإبرة واضغط على المحور على الذيل لتثبيت الإبرة في موضعها. لا تضغط بشدة ولا تمسك بعمود الإبرة ، لأن ذلك سيعيق تدفق السائل إلى الوريد.

بعد ذلك ، قم بتغيير وضع المحقنة التي تمسك باليد بحيث تمسك السبابة والإصبع الأوسط بالشفة ويكون الإبهام في نهاية المكبس. اضغط لأسفل على المكبس بحركة واحدة مستمرة وحقن الحجم الكامل للسائل في ست إلى ثماني ثوان. قم بإزالة الإبرة من الوريد وباستخدام منديل ، ضع ضغطا برفق على الذيل لوقف أي نزيف.

هنا يتم عرض عملية الحقن في الوقت الفعلي. لاحظ أنه لا ينصح بالإدخال الكامل للإبرة بسبب زيادة خطر قص الوريد بعد الحقن ، قم بإزالة الماوس من المقنع وضعه في قفص استرداد يوضع فوق وسادة التدفئة. إذا كانت غرفة الحقن باردة ، فهذه الخطوة ضرورية لبقاء الفأر.

تمسك بذيل الفأر حتى يتوقف النزيف تماما. راقب الماوس لمدة ساعة واحدة بعد الهيدروديناميكية. توصيل الحمض النووي.

تعتبر الفترة الأولية من اللهاث والجمود أمرا طبيعيا ، ولكن تأكد من أن الفأر يظهر علامات الشفاء. في غضون خمس دقائق تقريبا بعد تعافي الفأر ، أعده إلى قفص السكن وتأكد من حصوله على إمدادات وفيرة من الطعام والماء. بعد ذلك ، سنوضح حقن الذيل باستخدام وضع يد بديل.

هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما يكون من الضروري حقن الفئران بالقرب من قاعدة الذيل. على سبيل المثال ، عند تصحيح الحقنة الفاشلة في نفس اليوم أو عند حقن الفئران ذات ذيول أقصر ، قم بإعداد الفأر للحقن ووضعه في مصفاة. كما كان من قبل ، ضع اليد غير القابلة للحقن على سطح مستو مع ثني أربعة أصابع بزاوية 90 درجة ، يجب أن تستقر الأصابع فوق بعضها البعض.

إنشاء منصة ، أمسك ذيل الماوس بين الإبهام والإصبع المؤشر. باستخدام اليد الأخرى ، امسح المنطقة المراد حقنها بقطعة كحول. دع المنطقة تجف.

أمسك حقنة الحقن بيد الحقن I وامسكها من الحافة ونهاية المكبس جاهزة للحقن. ثم ضع المحقنة موازية للذيل مع توجيه الإبرة نحو جسم الماوس وشطبة الإبرة متجهة لأعلى. حقن كما كان من قبل لتقييم ما إذا كانت إضافة علامة الهسهسة في مواقع تسلسل محددة تتداخل مع المعالجة الصحيحة وإفراز البابون APO.

L تم حقن فئران البروتين ببلازميد يحمل واحدا من ثلاثة جينات البابون APO L ذات العلامات التفاضلية ، وبلازميد آخر يحمل البابون HPR. تم تقييم نجاح الحقن من خلال تحليل الدم الغربي لمستويات HPR المنتشرة في دم الفئران بعد يومين من الحقن. كما هو موضح هنا ، تم التعبير عن البابون HPR بشكل كبير في البلازما للجميع ، ولكن أحد الفئران المنقولة يشير إلى أن HGD كان ناجحا.

تنخفض طفيف في مستويات التعبير كما هو موضح في أحد الفئران في B APO L واحد ، تعزى مجموعة العلامات الخاصة به بشكل عام إلى انخفاض صغير جدا من ثانية إلى ثانيتين في سرعة الحقن. هنا ، يظهر حارة عينة البلازما الأولى نقصا تاما في التعبير عن البروتين. يشير هذا إلى فشل HGD على الأرجح بسبب الحقن غير المكتمل للحجم الكامل لمركبة التوصيل لتقييم تأثير وضع العلامات على B APO L ، كما تم تقييم تعبير إفراز واحد لعلامة الهسهسة كما هو موضح هنا.

كان هناك نقص كامل في البروتين الموسوم بعلامة hist الذي يمكن اكتشافه في المجموعتين الأولى والثانية. كانت المجموعة الوحيدة من الفئران التي لديها مستويات يمكن اكتشافها من البروتين في البلازما هي المجموعة الثالثة. مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن نقص البروتين الموسوم به في المجموعتين الأولى والثانية هو نتيجة للاختلافات في التعبير الجيني أو معالجة البروتين بدلا من فشل الحقن.

كما يسلط الضوء على أهمية تضمين بروتين التتبع في مزيج الحقن لمراقبة نجاح HGD. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الفئران والمحاقن وكيفية إدخال الإبرة في وريد الذيل للحقن السريع للحمض النووي التيميد للتعبير عن الجينات والفئران عن طريق توصيل الجينات الهيدروديناميكية. أصعب جانب في هذا الإجراء هو الحفاظ على الإبرة في موضعها طوال فترة الحقن.

قد تنام الإبرة التي يتم إدخالها بشكل صحيح خارج موضعها بسبب الحركة العرضية من قبل الشخص المحقن أو الفأر غير المخدر لزيادة فرصة النجاح. نتجنب حقن الفئران التي يزيد وزنها عن 27 جراما كمناولة حقنة تم تحميلها إلى ثلاثة مل. السعة أكثر صعوبة.

نجد أن الفئران التي يتراوح وزنها بين 23 و 27 جراما هي الأكثر ملاءمة للحقن. قد تكون عروق الفئران التي يقل وزنها عن 20 جراما صغيرة جدا بحيث لا يمكن حقنها.