السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة ملائمة للتحكم في تعبير القنوات الأيونية في الأنظمة غير المتجانسة مع تجنب مضاعفات زراعة الخلايا الطويلة. وبالتالي توفير طريقة للتحكم في الظروف بين التجارب وتوليد المزيد من النتائج القابلة للتكرار. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تسهيل البحث في مجال القناة الأيونية.

مثل توصيف خصائص القناة في علم الأدوية. نظرا لأن الطرق الحالية إما معقدة أو تظهر تعبيرا غير متسق عن البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تحقيق مستويات التعبير المتحكم فيها لمجموعة متنوعة من البروتينات المصممة للتجارب الفردية في غضون فترة زمنية قصيرة نسبيا.

لبدء هذا الإجراء ، قم بنقل خلايا TREX 293 إلى صفيحة 12 بئرا محضرة ب 0.9 مل من DMEM الكامل لكل بئر لتوليد التقاء بنسبة 50 بالمائة. واحتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط تعدي يتكون من DMEM ، الجين المعني ، الموضح هنا ، TRPV1 ، البلازميد الخامل ، وكاشف نقل الدهون.

بالنسبة للتجارب الفيزيولوجية الكهربية ، قم بتضمين EGFP في بلازميد التعبير عن الثدييات في كوكتيل التعدي من أجل تصور الخلايا التي تخضع بنجاح للتعدين. احتضان خليط التعداء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا عن طريق سحب خليط التعدي بالتنقيط على الخلايا المطلية في صفيحة 12 بئر.

هز اللوحة بقوة لضمان التشتت المتجانس للحمض النووي وكشف التعداد. بعد ذلك ، احتضان الخلايا المنقولة طوال الليل عند 27 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، في حالة إجراء الفيزيولوجيا الكهربية ، تأكد من أن الخلايا قد تم نقلها بنجاح من خلال مراقبة إشارة الفلورسنت ل EGFP تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

في حالة إجراء الفيزيولوجيا الكهربية ، قم بنقل الخلايا من لوحة 12 بئر إلى غطاء مطلي ب PDL في 500 ميكرولتر من DMEM الكامل. في حالة إجراء تصوير الكالسيوم ، قم بتحديد ما يقرب من 20،000 خلية في غرف تصوير الكالسيوم المطلية ب PDL. في هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول مخزون الدوكسيسيكلين بمقدار واحد ملليغرام لكل مليلتر في الماء المقطر المزدوج.

احم محلول المخزون من الضوء عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بمحلول مخزون الدوكسيسيكلين عند سالب 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الدوكسيسيكلين الطازج في DMEM الكامل.

وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية. بالنسبة للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية ، قم بعمل ماصة 500 ميكرولتر من محلول الدوكسيسيكلين بمعدل ميكروغرامين لكل ملليلتر لكل بئر لعمل تركيز نهائي من الدوكسيسيكلين عند ميكروغرام واحد لكل مليلتر. لتصوير الكالسيوم ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الدوكسيسيكلين بمعدل ثلاثة ميكروغرام لكل مليلتر إلى كل بئر لعمل تركيز نهائي من الدوكسيسيكلين بمعدل ميكروغرام واحد لكل مليلتر.

احتضان العينة لمقدار الوقت المطلوب للحث عند 37 درجة مئوية ، وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. لمعايرة تعبير البروتين من خلال تصوير الكالسيوم ، قم بإعداد محلول Ringer وتسخينه إلى 37 درجة مئوية. للمساعدة في تشتيت استرات AM ، تقوم مؤشرات الأيونات السائدة ، مثل Fura-2 في المواد المائية ، بإعداد محلول F-127 غير الأيوني في DMSO.

سخني المحلول إلى 27 درجة مئوية حتى يذوب F-127 غير الأيوني. ثم قم بتخزين محلول F-127 غير الأيوني في درجة حرارة الغرفة وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية مرة أخرى قبل الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول تحميل Fura-2 AM من محلول Ringer ، مكملا باثنين إلى ثلاثة ميكرومولار Fura-2 AM ، و 02 ملليغرام لكل مليلتر F-127 غير أيوني ، و 10 ملليمولار D-glucose.

ثم استنشق الوسط من الخلايا الموجودة في الغرف واستبدله بمحلول تحميل Fura-2 AM. احتضان الخلايا لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك ، استنشق محلول Fura-2 AM.

واغسل الخلايا بمحلول Ringer و 10 مللي مولار D-glucose لإزالة الصبغة الخلوية الزائدة. اترك 200 ميكرولتر من محلول Ringer's و 10 مللي مولار D-glucose في كل منهما. واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بعد 30 دقيقة ، ضع الغرفة على المسرح فوق قطعة أنف المجهر ، وثبتها بحامل. ثم حساب وإعداد تركيز العمل من الكابسيسين الناهض TRPV1 وفقا للتركيز النهائي المطلوب. بعد ذلك ، قم بتشغيل المصباح والكاميرا والمجهر ، وحدد مرشح Fura-2 للكشف عن الانبعاث بطول موجي 510 نانومتر.

اضبط التكبير المطلوب وركز الخلايا في الحقل المحدد عن طريق معالجة هذه المعلمات باستخدام مقابض المجهر. في الظلام ، اطرح ضوء الخلفية واضبط وقت التعريض الضوئي. تعيين أخذ عينات الصورة بمعدل الرغبة.

بعد ذلك ، ابدأ بتسجيل استجابة التألق للخلايا المحملة ب Fura-2 عن طريق إثارتها عند أطوال موجية 340 نانومتر و 380 نانومتر. نسبة 340 إلى 380 إشارة هي مؤشر لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا وبالتالي أيضا لنشاط TRPV1. بعد ذلك ، أضف اثنين من الكابسيسين الميكرومولار في 200 ميكرولتر من محلول Ringer لإنشاء تركيز تشبع نهائي من كبخاخات ميكرومولار واحدة من أجل تقييم مستوى التعبير عن TRPV1 وتحليل استجابة TRPV1.

لتحديد وقت الحث المثالي للتسجيل أحادي القناة، قم أولا بإعداد الحمام ومحاليل الماصة. ثم قم بإعداد بعض الماصات الزجاجية المصقولة بالحريق بمقاومة تتراوح من 10 إلى 12 ميغا أوم. قم بإجراء مشبك تصحيح الخلية بالكامل عن طريق إنشاء ختم على غشاء الخلية المستهدفة.

بعد ذلك ، اضبط إمكانات الاحتفاظ على سالب 40 مللي فولت. وتمزيق الغشاء بالضغط السلبي. بعد ذلك ، باستخدام المعالجة الدقيقة ، ارفع الماصة مع رقعة الميبران بعيدا عن الخلية.

ثم ضع نظام الوفرة بجوار الماصة التي تحتوي على رقعة الغشاء مباشرة. اخفض مرشح Bessel وكسب الإخراج إلى اثنين إلى خمسة كيلاهورتز و 10 أمبير على التوالي. بعد ذلك ، قم بغزارة التركيزات المشبعة من ناهض على رقعة الغشاء.

ثم قم بتحليل عدد التصحيحات أحادية القناة المسجلة بنجاح مقابل وقت الحث المطبق على الخلايا وضبط وقت الحث وفقا للنتائج المرجوة. تظهر هنا الصور الملونة الزائفة لخلايا TREX 293 التي تعبر بشكل عابر عن RTRPV1 ، قبل وبعد تطبيق الكابسيسين. وإليك التغييرات المقابلة لمستويات الكالسيوم داخل الخلايا مع مرور الوقت في خلايا TREX 293 المعالجة والمنقولة.

يمثل كل رسم بياني ما معدله 50 خلية. يعتمد معدل نجاح تصحيح القناة الواحدة في تسجيلات TRPV1 على وقت الحث. فيما يلي الآثار الحالية للبقع من خلايا TREX 293 التي تعبر بشكل عابر عن RTRPV1 بعد ساعتين وأربع ساعات من الحث.

وتصف هذه المخطط عدد القنوات في التصحيح بعد الوقت المحدد للحث. يمكن أن تعطينا هذه التقنية تحليل البروتين ذو التعبير المتحكم فيه في غضون 12 ساعة من التعدي إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توحيد تركيزات التعدي ووقت الحث للبروتينات المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج نظام تعبير يمكن التحكم فيه بطريقة فعالة من حيث الوقت للأيون الذي تختاره.