اكتشاف بروتين تفاعلات البروتين وتميز وظيفة عن طريق HaloTag تكنولوجيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجمعات البروتين بكفاءة عن خلايا الثدييات. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا أولا ببناء اندماج علامة هالة للتعبير عن البروتين محل الاهتمام. الخطوة الثانية هي تقطيع الخلايا والتقاط مجمعات البروتين تساهميا على الراتنج عبر علامة الهالة.

بعد ذلك ، يتم غسل مجمعات البروتين الموجودة على الراتنج برفق لإزالة أي تفاعلات غير محددة. الخطوة الأخيرة هي التخلص من مجمعات البروتين من الراتنج. في النهاية ، يتم استخدام علامات الهالة المنسدلة لعزل واكتشاف تفاعلات البروتين الجديدة من أنظمة الثدييات.

يمكن للطرق التي سنعرضها لك هنا اليوم أن تمكن من الاكتشافات الرئيسية في مجال البروتينات الوظيفية ، بما في ذلك تحديد تفاعلات البروتين الجديدة وتحديد توطين البروتين داخل الخلايا. يقوم اثنان من كبار العلماء لدينا اليوم بتنفيذ هذه الإجراءات ، جاكي مينديز وألين بيك. أولا ، لكل اندماج أو تحكم ، قم بإعداد طبق واحد بطول 15 سم مع 30 مليلترا من الخلايا بثلاثة إلى أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر ، أو واحد إلى 1.2 في 10 في الخلايا السبع لكل بناء.

احتضان الخلايا لمدة 18 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، قم بنقل البناء باستخدام كاشف التعداء المطلوب. بعد 24 إلى 48 ساعة ، بعد التعداء ، قم بإزالة الوسائط وغسل طبقة الخلية برفق مع 20 إلى 25 مل من PBS المثلج ، قم بإزالة غسل PBS وإضافة 25 إلى 30 مل من أربع درجات مئوية PBS المبردة.

بعد ذلك ، اكشط الخلايا برفق من الطبق باستخدام مكشطة الخلية. بمجرد جمع الخلايا في أنابيب مخروطية الشكل ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 2000 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، ضع حبيبات الخلية عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة لا تقل عن 30 دقيقة أو ستة أشهر كحد أقصى.

لكل عينة اندماج أو تحكم ، قم بإعداد 18 مل من مخزن غسيل توازن الراتنج. امزج الراتنج برفق عن طريق قلب القارورة للحصول على تعليق موحد. لكل تجربة منسدلة ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الراتنج في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

الطرد المركزي العينة لمدة دقيقة واحدة عند 800 مرة G. بعد الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الراتنج في قاع الأنبوب. بمجرد التخلص من المادة الطافية ، أضف 800 ميكرولتر من مخزن غسيل توازن الراتنج إلى العينة واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. بعد.

الطرد المركزي للعينة لمدة دقيقتين عند 800 مرة. ز- قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية. كرر الخطوات السابقة مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات.

بعد إذابة كريات الخلية ، قم بتعليقها في 300 ميكرولتر من تحلل الثدييات المعدة مسبقا. قم بالمخزن المؤقت عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم انقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف ستة ميكرولترات من كوكتيل مثبط البروتياز 50 ×.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من RQ واحد من الحمض النووي واقلب العينة لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، يتم تمرير العينة من خمس إلى 10 مرات من خلال إبرة حقنة قياس 25 أو 27. بمجرد أن يتم طرد العينة عند 14،000 مرة ، G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، انقل المحللة الصافية إلى أنبوب جديد وضعها على الجليد.

بعد ذلك ، أضف 700 ميكرولتر إضافي من مخزن XTBS المعد مسبقا إلى المحللة الصافية واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. قم بإزالة الغسالات النهائية من أنابيب الراتنج المتوازنة المعدة مسبقا دون إزعاج الراتنج في قاع كل أنبوب. ثم أضف ملليلتر واحد من المحللة المخففة إلى كل أنبوب.

احتضان العينات بالخلط على أنبوب دوار لمدة 15 دقيقة عند 22 درجة مئوية. بعد جهاز الطرد المركزي هذا ، يتم استخدام أنابيب الراتنج لمدة دقيقتين عند 800 مرة G.بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف ملليلترا واحدا من مخزن غسيل توازن الراتنج واخلطه جيدا عن طريق قلب كل أنبوب راتنج يدويا عدة مرات بعد الطرد المركزي لأنابيب الراتنج لمدة دقيقتين عند 800 مرة. ز- تجاهل الغسالات بمجرد تكرار الخطوات السابقة والغسيل ثلاث مرات.

أضف ملليلترا واحدا من مخزن غسيل توازن الراتنج إلى الأنابيب بعد احتضان العينات عند 22 درجة مئوية لمدة خمس دقائق مع دوران مستمر ، وقم بالطرد المركزي لأنابيب الراتنج لمدة دقيقتين عند 800 مرة G وتخلص من الغسيل. في هذه المرحلة ، يقوم النسخ بتعليق الراتنج من كل عينة في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف SDS. رج الأنابيب في درجة حرارة الغرفة باستخدام شاكر أنبوب الطرد المركزي الأوتوماتيكي لمدة 30 دقيقة.

بعد الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 800 مرة G.انقل EITs إلى أنابيب جديدة للتحليل بالنسبة للبقعة الغربية أو هلام البقع الفضية ، قم بتحميل خمسة إلى 10 ميكرولترات من العينات على جل تغيير طبيعة SDS لقياس الطيف الكتلي. قم بتخزين 40 ميكرولترا من كل عينة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لتحليلها في المستقبل. في زجاج غطاء بثماني غرف جيدة لكل بروتين اندماج أو لوحة تحكم ، 400 ميكرولتر من خلايا HELOC في وسائطها المناسبة في كل بئر بكثافة من واحد إلى اثنين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر.

بعد احتضان الخلايا لمدة 18 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، قم بنقلها بكاشف التعداء المطلوب بعد 18 إلى 24 ساعة ، بعد التعداء ، قم بتخفيف ترابط TMR من واحد إلى 200 في الوسائط الخلوية المناسبة. ثم أضف 100 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر واخلطه برفق. بعد ذلك ، احتضان الخلايا المنقولة التي تحتوي على الترابط لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عند الانتهاء ، قم بالشفط من الوسائط التي تحتوي على الترابط واستبدلها ب 500 ميكرولتر من الوسائط المناسبة التي تفتقر إلى ترابط علامة اندماج البروتين ، والتي تم تحذيرها مسبقا إلى 37 درجة مئوية. بمجرد تكرار الخطوة السابقة مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات. ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، استنشق الوسائط واستبدلها ب 500 ميكرولتر من الوسائط المناسبة ، والتي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية. بعد هذه الصورة ، لوحظت الخلايا الموجودة على المجهر باستخدام معلمات الاستحواذ المناسبة باستخدام هالة البروتوكول و BRD four وتعبير التحكم في علامة الهالة. يمكن أيضا اكتشاف تعبير بروتين الاندماج باستخدام البقع الغربية مع الأجسام المضادة لعلامة الهالة أو الأجسام المضادة لبروتين الطعم.

تظهر المواد الهلامية للبقع الفضية للتكرارات البيولوجية ل Halo BRD four وعمليات السحب المنسدلة للتحكم قابلية عالية للتكاثر وتظهر البروتينات التي تتفاعل مع بروتين BRD الأربعة. تؤكد الوفرة العالية للمكونات من PTF B CDK nine و Cyclin T بالإضافة إلى بروتين BRD التسعة التقاط محدد لمجمعات BRD الأربعة. أظهرت المواد الهلامية بروتينات أخرى تم تحديدها على أنها تفاعلات محتملة ل BRD أربعة.

كمثال إضافي ، تم إجراء عزلات معقدة باستخدام بروتين Halo HD one. في هذه الحالة ، تم استخدام بروتياز TEV للانقسام في منطقة الرابط بين علامة Halo و H DAC ، مما يؤدي إلى إطلاق كميات كبيرة من بروتين الطعم العالي الدقة. كما لوحظ.

أظهرت عينات منسدلة عالية الدقة مستويات عالية من نشاط HD واحد ، والذي تم تثبيطه بواسطة مثبط HDA saha. لإثبات الخصوصية بشكل أكبر ، لم يلاحظ أي تثبيط HDA مع مثبط عائلة السيرتوين EX 5 27 ولم يتم الكشف عن أي إشارة باستخدام العازلة وحدها. تم تصنيف الخلايا التي تم نقلها باستخدام Halo BRD four و Halo HDAC one بالفلورسنت باستخدام TMR.

أظهر Ligand Imaging أن كلاهما مترجم في النواة ويوضح أن العلامة لم تغير التوطين الخلوي الفسيولوجي لشركائها في الاندماج. لذلك باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحديد البروتينات المعزولة وشركائها المتفاعلين وتحليلها بشكل أكبر باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق التحليلية مثل قياس الطيف الكتلي والنشاف الغربي.