اكتشاف بروتين تفاعلات البروتين وتميز وظيفة عن طريق HaloTag تكنولوجيا

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في عزل المعقدات البروتينية من الخلايا الثديية بكفاءة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفكشن الخلايا بنظام دمج halo tag للتعبير عن البروتين المراد دراسته. وتتمثل الخطوة الثانية في تحلل الخلايا والالتقاط التساهمي للمعقدات البروتينية على الراتنج عبر halo tag.

بعد ذلك، تُغسل المعقدات البروتينية الموجودة على الراتنج بلطف لإزالة أي تفاعلات غير نوعية. وتتمثل الخطوة النهائية في استرداد المعقدات البروتينية من الراتنج. وفي نهاية المطاف، تُستخدم تقنية سحب الـ halo tag لعزل واكتشاف تفاعلات بروتينية جديدة من الأنظمة الثديية.

يمكن للطرق التي سنوضحها لكم اليوم أن تتيح اكتشافات رئيسية في مجال البروتوميات الوظيفية، بما في ذلك تحديد تفاعلات بروتينية جديدة وتحديد تموضع البروتين داخل الخلايا. ويقوم بتنفيذ هذه الإجراءات اليوم اثنان من كبار علمائنا، جاكي مينديز وألين بيك. أولاً، لكل دمج أو عينة ضابطة، قم بتحضير طبق واحد بقطر 15 سنتيمتر يحتوي على 30 ملليلتر من الخلايا بتركيز يتراوح من 3 إلى 4 × 10⁵ خلية/ملليلتر، أو إجمالي 1 إلى 1.2 × 10⁷ خلية لكل بناء جيني.

يُحضن الخلايا لمدة تتراوح من 18 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5%CO2. وبعد فترة التحضين، يتم ترانسفكشن البناء باستخدام كاشف الترانسفكشن المطلوب. وبعد مرور 24 إلى 48 ساعة من الترانسفكشن، يُزال الوسط ويُغسل طبق الخلايا برفق باستخدام 20 إلى 25 ملليلتر من PBS بارد جداً، ثم يُزال غسول PBS ويُضاف 25 إلى 30 ملليلتر من PBS مبرد عند 4 درجات مئوية.

بعد ذلك، قم بكشط الخلايا بلطف من الطبق باستخدام كاشطة خلايا. وبمجرد جمع الخلايا في أنابيب مخروطية، قم بطرد العينات مركزياً لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند 2000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. وبعد التخلص من الطافي، ضع كتل الخلايا عند درجة حرارة -80 °C لمدة لا تقل عن 30 دقيقة وبحد أقصى ستة أشهر.

لكل عينة دمج أو عينة ضابطة، قم بتحضير 18 milliliters من محلول غسل موازنة الراتنج. اخلط الراتنج برفق عن طريق قلب القارورة للحصول على معلق متجانس. لكل تجربة سحب (pull down)، وزع 200 microliters من الراتنج في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter.

قم بطرد العينة مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 800 ×g. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي بعناية دون تحريك الراتنج الموجود في قاع الأنبوب. وبمجرد التخلص من السائل الطافي، أضف 800 µL من منظم غسيل موازنة الراتنج إلى العينة وامزجها جيداً عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. بعد ذلك.

يتم طرد العينة مركزياً لمدة دقيقتين عند 800 ×g. يُزال الطافي بعناية ويُتخلص منه. تُكرر الخطوات السابقة مرتين إضافيتين لإتمام ثلاث عمليات غسيل في المجمل.

بعد إذابة كرات الخلايا المجمدة، قم بإعادة تعليقها في 300 µL من منظم التحلل الثديي (mammalian lysis buffer) الذي تم تحضيره مسبقاً عن طريق السحب والضخ بالماصة. ثم انقل المزيج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 6 µL من كوكتيل مثبط البروتياز بتركيز 50x.

بعد ذلك، أضف 3 µL من RQ one DNAs واقلب العينة لمدة 10 دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، قم بتحليل الخلايا عن طريق تمرير العينة من خمس إلى 10 مرات عبر إبرة حقنة بقياس 25 أو 27 gauge. وبمجرد طرد العينة مركزياً بسرعة 14,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C، انقل الراشح الصافي إلى أنبوب جديد وضعه على الثلج.

بعد ذلك، أضف 700 µL إضافية من منظم XTBS الذي تم تحضيره مسبقاً إلى المستخلص الشفاف، واخلطه جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة. قم بإزالة غسلات الشطف النهائية من أنابيب الراتنج المتوازنة التي تم تحضيرها مسبقاً دون تحريك الراتنج الموجود في قاع كل أنبوب. ثم أضف 1 mL من المستخلص المخفف إلى كل أنبوب.

يتم تحضين العينات مع الخلط باستخدام جهاز تدوير الأنابيب لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 22 °C. بعد ذلك، يتم إجراء طرد مركزي لأنابيب الراتنج لمدة دقيقتين عند 800 ×g. بعد التخلص من السائل الطافي، يُضاف 1 mL من منظم غسيل موازنة الراتنج ويُخلط جيداً عن طريق قلب كل أنبوب راتنج يدوياً عدة مرات، يليه إجراء طرد مركزي لأنابيب الراتنج لمدة دقيقتين عند 800 ×g. يتم التخلص من محاليل الغسيل بمجرد تكرار خطوتي الغسيل السابقتين ثلاث مرات.

أضف 1 mL من منظم غسيل موازنة الراتنج إلى الأنابيب بعد تحضين العينات عند 22 °C لمدة خمس دقائق مع الدوران المستمر، ثم قم بطرد مركزي لأنابيب الراتنج لمدة دقيقتين عند 800 ×g وتخلص من نواتج الغسيل. عند هذه النقطة، أعد تعليق الراتنج من كل عينة في 50 µL من منظم استخلاص SDS. رج الأنابيب في درجة حرارة الغرفة باستخدام هزاز أنابيب طرد مركزي دقيق أوتوماتيكي لمدة 30 دقيقة.

بعد إجراء عملية الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 800 ×g، يتم نقل الـ EITs إلى أنابيب جديدة للتحليل. وبالنسبة لاختبار لطخة وسترن (western blot) أو صبغ الجل بالفضة، يتم تحميل من 5 إلى 10 µL من العينات على جل SDS المسنن لتحليل مطيافية الكتلة. تُحفظ كمية 40 µL من كل عينة عند درجة حرارة -20 °C للتحليلات المستقبلية. وفي غطاء زجاجي ذو ثماني حجرات لكل بروتين اندماجي أو لوحة تحكم، يتم وضع 400 µL من خلايا HELOC في أوساطها الغذائية المناسبة في كل حجرة بكثافة تتراوح من 1 إلى 2 × 10⁵ خلية/mL.

بعد تحضين الخلايا لمدة تتراوح من 18 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5%CO2، يتم ترنسفكشن الخلايا باستخدام كاشف الترنسفكشن المطلوب؛ وبعد مرور 18 إلى 24 ساعة من عملية الترنسفكشن، يتم تخفيف ربيطة TMR بنسبة 1 إلى 200 في الوسط الخلوي المناسب. ثم يُضاف 100 µL من هذا المحلول إلى كل بئر مع المزج بلطف. بعد ذلك، تُحضن الخلايا المترنسفكشن التي تحتوي على الربيطة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و5%CO2.

عند الانتهاء، قم بشفط الوسط الذي يحتوي على اللجند واستبدله بـ 500 microliters من الوسط المناسب الخالي من لجند علامة دمج البروتين، والذي تم تدفئته مسبقاً إلى 37 degrees Celsius. وبمجرد تكرار الخطوة السابقة مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات، أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.

بعد فترة تحضين مدتها 30 دقيقة، يتم سحب الوسط وسحب السوائل واستبدالها بـ 500 µL من الوسط المناسب الذي تم تسخينه مسبقاً إلى 37 °C. بعد ذلك، يتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر مع تطبيق معايير الالتقاط المناسبة، حيث يتم رصد التعبير عن البروتينات المدمجة halo و BRD4 و halo tag control. كما يمكن الكشف عن التعبير عن البروتين المدمج باستخدام لطخة وسترن (Western blots) بواسطة أجسام مضادة لـ halo tag أو أجسام مضادة للبروتين الطعم (bait protein).

تُظهر هلامات صبغة الفضة للمكررات البيولوجية لعمليات السحب لبروتين Halo BRD four والمجموعات الضابطة قابلية تكرار عالية، وتكشف عن البروتينات التي تتفاعل مع بروتين BRD four. كما يؤكد الوفرة العالية لمكونات PTF B و CDK nine و Cyclin T، بالإضافة إلى بروتين BRD nine، الالتقاط النوعي لمعقدات BRD four. وقد أظهرت الهلامات بروتينات أخرى تم تحديدها كمتفاعلات محتملة لبروتين BRD four.

وكمثال إضافي، تم إجراء عمليات عزل معقدة باستخدام بروتين Halo HD one. وفي هذه الحالة، استُخدم إنزيم TEV protease للقطع في منطقة الرابط بين وسم Halo وبروتين H DAC one، مما أدى إلى تحرير كميات كبيرة من بروتين الطُعم HD one، كما هو ملاحظ.

أظهرت عينات الترسيب المناعي لـ HD one مستويات عالية من نشاط HD one، والتي تم تثبيطها بواسطة مثبط HDA المعروف باسم saha. ولإثبات النوعية بشكل أكبر، لم يتم ملاحظة أي تثبيط لـ HDA باستخدام مثبط عائلة السيرتوين EX 5 27، كما لم يتم رصد أي إشارة عند استخدام المحلول المنظم وحده. وقد تم وسم خلايا He A التي تم ترنسفكشنها بـ Halo BRD four و Halo HDAC one فلوروسنتياً باستخدام TMR.

أظهر تصوير الربيطة أن كليهما يتمركزان في النواة، كما أثبت أن الوسم لم يغير التموضع الخلوي الفسيولوجي لشركاء الاندماج الخاص به. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تحديد البروتينات المعزولة والشركاء المتفاعلين معها وتحليلهم بشكل أكبر باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق التحليلية مثل مطيافية الكتلة واللطخة الغربية.