تحديد البروتين البروتين التفاعل في ذبابة الفاكهة رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية البروتينات المتفاعلة في الجسم الحي للجين ذي الأهمية من الدماغ البالغ لذبابة الفاكهة. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد الذباب المعدل وراثيا أولا الذي يعبر عن بروتين الطعم الموسوم بالصنبور وجمع الرؤوس البالغة من هذه الذباب. الخطوة الثانية هي تحضير المادة الطافية من محللة رأس الذبابة لإجراء الصنبور ، ثم إجراء تنقية الغلوبين المناعي G المتسلسلة ، وانقسام TEV وتنقية مودلين cal.

التطور الخمسة التالي الذي تم جمعه من الخطوة الأخيرة من إجراء النقر جنبا إلى جنب مع محللة الدماغ الكلية ومركب البروتين. بعد حل انقسام TEV بواسطة صفحة SDS وتصورها عن طريق تلطيخ الفضة. في النهاية ، يخضع الشطف الثاني عادة لقياس الطيف الكتلي لتحديد البروتين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على mes الموجودة مثل تجارب TAL الهجينة وتجارب IP الأساسية ، هي أن تفاعلات بروتين البروتين التي تم اكتشافها بواسطة الصنبور تحدث في ظل ظروف فسيولوجية قريبة ، مما يساعد في الحفاظ على خصوصية تلك التفاعلات. تتيح جولتان من خطوات التنقية إثراء النتائج المحددة وتقليل معدل الإيجابية الكاذبة. سيتم عرض الإجراء من خلال مرحلة ما بعد الدكتوراه من مختبري.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بتوسيع مخزون الجينات المعدلة وراثيا من GAL العصبي الأربعة من الطائرات بدون طيار في زجاجات واقلب الزجاجات كل ثلاثة أيام حتى يتم استخدام 250 زجاجة للتجميع. اجمع الذباب البالغ البالغ من يوم إلى ثلاثة أيام في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وضع الأنبوب في النيتروجين السائل على الفور لتجميد الذباب بعمق. بعد هذا المتجر ، يطير في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قم بإزالة غربالين اختباريين قياسيين مبردين مسبقا في الولايات المتحدة الأمريكية وملاط ومدقة من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر وضعهما داخل دلو ثلج كبير مملوء بمسحوق الثلج الجاف. ثم قم بتكديس غربال الرقم 25 أعلى غربال الرقم 40 في الدلو. بعد إخراج الذباب المجمد من الفريزر ، ضعه في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق تقريبا.

عند الانتهاء ، هز الأنبوب بقوة لكسر الرؤوس والساقين والأجنحة من الأجسام. بعد ذلك ، اسكبي المزيج على المنخل العلوي ورجي المناخل بقوة مع تثبيتها معا. عند الانتهاء ، افصل المناخلين وانقل رؤوس الذبابة بعناية من المنخل السفلي إلى الملاط البارد فوق الثلج الجاف في دلو ثلج ، وطحن الرؤوس بالهاون والمدقة إلى جزيئات مسحوقة ونقل المسحوق إلى مطحنة مناديل زجاجية مبردة مسبقا ووزنها مسبقا.

ثم قم بقياس وزن المطحنة بعينة الرأس واحسب مقدار وزن عينة الرأس بالمطحنة الزجاجية على الجليد. أضف 15 مل من مخزن التجانس المثلج المعد مسبقا إلى المسحوق وقم بالسكتة الدماغية بمدقة الخلوص الكبيرة حتى تتحرك المدقة لأعلى ولأسفل المطحنة بسهولة. بعد ذلك ، قم بنقل الجانس إلى أنبوب طرد مركزي عالي السرعة وقم بتدويره لمدة 20 دقيقة عند حوالي 50،000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية.

عند الانتهاء ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد عالي السرعة. بعد تكرار الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي فائق وقم بتدويرها لمدة 40 دقيقة عند حوالي 250،000 مرة من الجاذبية عند أربع درجات مئوية. لمزيد من المسح الخارق أثناء الطرد المركزي للعينة ، انقل 400 ميكرولتر من الخرز الغلوبين المناعي g Sphero إلى أنبوب صقر سعة 15 مل.

بعد إضافة 10 ملليلتر من محلول غسيل الغلوبين المناعي البارد G ، قم بهز الأنبوب برفق لمدة دقيقتين. عند الانتهاء ، قم بتدوير الخرزات لأسفل بقوة 1000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقتين أخريين. بعد تكرار هذه العملية مرتين أخريين ، قم بإزالة المخزن المؤقت ، مع ترك الخرز فقط في الأنبوب بعد الطرد المركزي.

انقل بعناية ما يقرب من 15 مل من المادة الطافية التي تم تطهيرها إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبات الغلوبين المناعي G. احتضان الخرز وتحلل الدماغ امزج عند أربع درجات مئوية على مطفر لمدة ساعتين في غرفة باردة ، قم بإعداد عمود صغير نظيف وفارغ سعة 15 ملليلترا. قم بتحميل خليط حبة الغلوبين المناعي G عن طريق سكبه بثبات في العمود.

بعد أن يلمح محلل الدماغ من عمود الغلوبين المناعي G المستقر ، اغسله جيدا ب 10 ملليلتر من محلول الغسيل البارد من الغلوبين المناعي G. كرر الغسيل مرتين ، مع التأكد من عدم ترك الخرزات تجف. بعد الغسيل الثالث ، اغسل العمود ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للانقسام TEV قبل آخر قطرة من عازلة TEV Elutes من العمود.

أغلق الجزء السفلي من العمود بغطاء لمنع التدفق. ثم أضف 1.3 مل من المخزن المؤقت TEV الذي يحتوي على 130 وحدة من إنزيم TEV إلى العمود وأغلق الجزء العلوي بغطاء. قم بتدوير العمود عند 18 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح لإنزيم TEV بشق الببتيد في موقع TEV وإطلاق مركب البروتين أثناء تحضين حبات الغلوبين المناعي بإنزيم TEV.

ضع 200 ميكرولتر من حبات Cal Modlin في أنبوب فالكون سعة 15 مليلتر واغسلها ثلاث مرات باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت البارد لربط Cal modlin لكل غسلة. هز الأنبوب لمدة دقيقتين على متحور ثم قم بتدوير الخرزات بقوة 1000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقتين. في نهاية الغسيل الثالث ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الأنبوب.

بمجرد اكتمال حضانة TEV ، اضبط عمود الغلوبين المناعي G في الغرفة الباردة واترك الخرزات تستقر لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الأغطية العلوية والسفلية واجمع منتج انقسام TEV سعة 1.3 مليلتر في أنبوب صقر سعة 15 مل. بعد السماح للمخزن المؤقت بالتصريف تماما ، أضف 200 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت TEV إلى العمود واجمع EENT في نفس الأنبوب.

بعد ذلك ، أضف 4.5 مل من المخزن المؤقت الملزم Cal Modlin و 4.5 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المولي إلى أنبوب منتج الانقسام TEV سعة 1.5 ملليلتر. انقل خليط الستة ملليلتر إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبات كال مودلين. بعد تدوير الأنبوب على متحور عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، قم بإعداد عمود صغير آخر نظيف وفارغ سعة 10 مليلتر في الغرفة الباردة.

قم بتحميل خليط حبة كال مودلين في العمود واتركه يجف عن طريق الجاذبية. عندما يلمح كل المحلول من خلال عمود Cal Modlin المستقر ، اغسل العمود بعناية مرتين باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت البارد لربط Cal Modlin. مباشرة بعد الغسيل ، أضف برفق 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد لشطف السعرات الحرارية إلى العمود واجمع EIT بأنبوب einor مميز سعة 1.5 مل.

كرر هذه الخطوة أربع مرات أخرى لتجميع ما مجموعه خمسة كسور. بعد ذلك ، قم بتحليل محتويات البروتين لكل جزء بواسطة صفحة SDS. قم بتخزين EIT المتبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من التحليل.

البروتين المتفاعل Highwire ومتماثلات الفقاريات واللافقاريات هي ubiquitin ligase ضخمة تنظم تطور وإصلاح الجهاز العصبي. أدى العمل المنجز في الدودة والذبابة والفأر إلى نموذج العمل الحالي الذي يعمل highwire كثلاثة ليجاسات E وكبروتين سقالات لتسهيل تكوين مركب متعدد الوحدات الفرعية ، والذي ينظم الوقت والوظائف العصبية المحددة لنوع الخلية. من خلال الجمع بين التفاعل مع العوامل المشتركة المختلفة واستهداف ركائز يوبيكويتين المختلفة.

لتحديد مركب الانتشار المرتبط بالسلك العالي والعلامة الطرفية النهائية إلى UAS ، قم بالنقر فوق الجينات المعدلة والسلكية التي تعمل بكامل طاقتها. في إنقاذ النمط الظاهري المتحور عالي الأسلاك ، تم إنشاء حوالي 10 جرامات من رؤوس الذباب البالغة التي عبرت عن النقر فقط أو النقر على البروتينات المعدلة وراثيا عالية الأسلاك ، وتم جمعها وإخضاعها لإجراءات النقر جنبا إلى جنب كما هو موضح أعلاه. تم تحليل EITs النهائية من كلا التنقية بواسطة صفحة SDS ثم حدد قياس الطيف الكتلي لتلوين الفضة قائمة من البروتينات في عينة الصنبور عالية الأسلاك فقط بما في ذلك ذبابة الفاكهة FSN وريون.

كشفت التحليلات الجينية والكيميائية الحيوية اللاحقة أن HIGHWIRE و DFSN يعملان معا كمقياس SCF ، مثل مركب E three ubiquitin ligase لتنظيم البنية والوظيفة المشبكية ، ويرتبط reone ب highwire in vivo وتقييد فرط النمو المتشابك. يتم تحقيق وظيفة reone هذه جزئيا على الأقل من خلال قدرتها على تعزيز استقرار البروتين عالي الأسلاك من خلال حماية Highwire من التحلل الذاتي ، مما يكشف عن آلية جديدة تتحكم بشكل انتقائي في وفرة البروتين عالي الأسلاك أثناء التطور المشبكي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إلى ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إنشاء الشكل الصحيح للكشف عن الجينات المعدلة وراثيا ، وتحديد التحويل الذي يعبر عن الجينات المعدلة وراثيا على المستوى المناسب ، وأخيرا ، والأهم من ذلك ، تمويل ظروف المخزن المؤقت الصحيحة التي لا تذوب البروتين الأساسي فحسب ، بل تحافظ أيضا على مجمعات InVivo السليمة في حالة مستقرة نسبيا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية ربط الشك ، والذبابة ، وإجراء تجربة تنقية التقارب الترادفي لتنقية بروتينات حقن الجينات المفضلة لديك في الخلايا العصبية.