مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء التهجين الجينومي المقارن باستخدام المصفوفات (array comparative genomic hybridization) لتحديد الاختلالات في الجينوم التي يمكن أن تؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض الوراثية. ويتم تحقيق ذلك من خلال وسم الحمض النووي DNA الخاص بالمريض أولاً بصبغة فلورية. وفي الخطوة الثانية، يتم تهجين الحمض النووي DNA الخاص بالمريض وحمض نووي مرجعي مـوسـوم بصبغة مختلفة على المصفوفة.

بعد ذلك، يتم مسح المصفوفة لقياس كمية DNA المريض والمرجع المرتبط بكل مسبار. وفي الخطوة النهائية، تتم معالجة الصورة الممسوحة لتحديد مناطق الجينوم التي تحتوي فيها DNA المريض على مادة أكثر أو أقل من DNA المرجع في المصفوفة النهائية. يُستخدم التهجين الجينومي المقارن لتحديد ما إذا كان المريض يحمل تغيراً في عدد النسخ يؤدي إلى متلازمة وراثية.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن تجميع شريحة المصفوفة قد يكون صعباً، ومن السهل أن ينسكب مزيج التهجين خارج الغرفة. قبل البدء بتفاعل الوسم، يتم إذابة طبق الـ 96 بئراً الجاهز للاستخدام والذي يحتوي على النيوكليوتيدات والبادئات عند درجة حرارة 4 °C مع حمايته من الضوء لمدة ساعة تقريباً.

بمجرد إذابة الثلج، اترك اللوح المغطى لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى حالة الاتزان، وفي الوقت نفسه، قم بموازنة عينات DNA لمدة 15 دقيقة عند 60 °C. وأثناء تدفئة العينات، استخدم روبوت مناولة السوائل لتوزيع كمية كافية من الماء الخالي من النيوكلييز في كل بئر من ألواح 96 بئر جديدة. بعد ذلك، وعندما يصبح الـ DNA جاهزاً، انقل 1 µg من العينة لكل بئر إلى لوح 96 بئر الذي يحتوي على الماء.

الآن، انقل 20 µL من النيوكليوتيدات والبادئات الموازنة إلى كل بئر في اللوح الذي يحتوي على عينات DNA المخففة، وأغلق اللوح باستخدام أغطية شرائطية مع الحرص على إحكام الغلق. بعد ذلك، قم بمسخ DNA عند 99 °C في جهاز PCR ذو غطاء مسخن لمدة 10 دقائق، ثم قم بتثبيت البادئات عن طريق التبريد المفاجئ للوح على الثلج لمدة خمس دقائق. ثم استخدم روبوت مناولة السوائل لإضافة 10 µL من إنزيم clean out exo DNA polymerase إلى كل عينة.

امزج العينات باستخدام الماصة، ثم أغلق الطبق بإحكام وحضنه عند 37 °C لمدة 16 ساعة. وفي اليوم التالي، أوقف التفاعل بإضافة 5 µL من محلول الإيقاف (stop buffer) لكل بئر، ثم تخلص من النيوكليوتيدات غير المدمجة. انقل محتويات كل بئر إلى أنابيب سعة 2 mL مجهزة بملصقات تعريفية مسبقاً.

قم بتحميل العينات وأعمدة تنقية DNA الدورانية في روبوت معالجة الأعمدة الدورانية، بالإضافة إلى المحاليل المنظمة المرتبطة بها. ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، سيقوم روبوت معالجة الأعمدة الدورانية بربط DNA المسمى بالغشاء السيليكي باستخدام 250 microliters من محلول ربط DNA عالي الملوحة لكل أنبوب، وبعد ذلك ستتم إزالة الشوائب من الأغشية عن طريق غسلتين بمقدار 500 microliters من محلول الغسيل لكل منهما. ثم سيضيف الروبوت 15 microliters من محلول استرداد منخفض الملوحة إلى الأغشية لاستعادة عينات DNA المسمى المنقاة في أحجام تقريبية تبلغ 12 microliter لتهجين العينات.

بعد ذلك، يتم تسخين فرن التهجين مسبقاً إلى 65 °C وتدفئة شرائح الدعم وغرف التهجين. لتحضير خليط التهجين، اخلط 1.1 µL من cot 1D NA و 4.95 µL من خليط الحجب المرفق من الشركة المصنعة، و 24.75 µL من محلول التهجين المنظم. استخدم روبوت مناولة السوائل لتوزيع هذا الخليط في كل بئر من طبق جديد يحتوي على 96 بئراً، مع ترطيب كل طرف مسبقاً لتعزيز دقة النقل.

بعد ذلك، يتم سحب 9.35 µL من الحمض النووي DNA المسمى بـ signing، three باستخدام الماصة، يليه 9.35 µL من الحمض النووي DNA المسمى بـ signing، five. قم بإغلاق اللوحة بإحكام في كل بئر، ثم قم بعمل fourex للعينات لمدة دقيقة واحدة، وقم بتدوير اللوحة بسرعة لجمع المحتويات في قاع كل بئر. قم بمسخ الحمض النووي DNA المسمى في حاضنة ما قبل التهجين.

أولاً لمدة ثلاث دقائق عند 95 °C، تليها 30 دقيقة عند 37 °C. ثم العمل على منصة تسخين بدرجة حرارة 42 °C. ضع شريحة الدعم في غرفة التهجين، مع التأكد من محاذاة الجزء الشفاف من الحاشية مع الجزء النافذي من غرفة التهجين باستخدام رؤوس ماصات مبللة مسبقاً.

الآن، قم بنقل 42 µL من خليط التهجين ببطء باستخدام الماصة إلى مركز الموضع المناسب من شريحة الدعم الخاصة بالمصفوفة. مع الحرص على ألا يلامس السائل حدود الحلقة المطاطية. وبمجرد ملء جميع المواضع، قم بخفض شريحة المصفوفة بعناية فوق شريحة الدعم وتجميع غرفة التهجين.

تأكد من أن جانب المصفوفة الذي يحتوي على الكتابة مواجه للشريحة الخلفية، ثم أحكم ربط برغي غرفة التهجين تماماً وافحص غرفة التهجين المجمعة، للتأكد من عدم وجود تسرب لمحلول التهجين خارج حدود الحلقة المطاطية ومن أن كل فقاعة هواء يبلغ ارتفاعها حوالي 4 mm. وللتحقق من ذلك، قم بتدوير غرفة التهجين أثناء وضعها بشكل عمودي على طرفها.

تتحرك جميع الفقاعات الهوائية في كل موضع. إذا كانت أي من الفقاعات عالقة، قم بالنقر بقوة على الغرفة فوق طاولة المختبر. بعد ذلك، ضع غرف التهجين في الفرن الدوار عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، تُغمر غرف التهجين في محلول غسيل 1، وتُستخدم ملاقط بلاستيكية مسطحة الحواف لفصل الشرائح. بعد ذلك، يتم التخلص من شرائح الحاشية وتوضع شرائح المصفوفة في حامل مغمور في محلول غسيل 1 جديد. تُغسل شرائح المصفوفة في حوالي 700 milliliters من محلول الغسيل لمدة تتراوح من دقيقة إلى خمس دقائق، مع التقليب القوي باستخدام قطعة مغناطيسية صغيرة ومحرك مغناطيسي.

بعد ذلك، انقل شرائح المصفوفة إلى حوالي 700 milliliters من محلول الغسيل المنظم، مرتين لمدة 90 seconds مع تحريك أكثر قوة في نهاية الغسلة الثانية. ارفع شرائح المصفوفة برفق من المحلول المنظم، حيث يجب أن تخرج جافة.

بعد ذلك، يتم وضع شرائح المصفوفة في حاملات الشرائح بجهاز الماسح الضوئي مع واقيات الشرائح، ثم تُمسح العينات ضوئياً. وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة للمصفوفة، يتم تصوير كل مسبار في المصفوفة المهجنة على شكل خليط من الفلوروكرومات الحمراء والخضراء. ويقوم الماسح الضوئي بقياس نسب الإشارة الفلورية الحمراء إلى الخضراء لكل مسبار، ثم يقوم البرنامج المرتبط برسمها كنسب لوغاريتمية أساس 2 (log two ratios) وفقاً لمواقعها الجينومية.

تسمح آثار المصفوفة الناتجة بتفسير المناطق التي تم تحديدها على أنها غير متوازنة جينومياً. على سبيل المثال، في هذا الأثر المأخوذ من طفل مصاب بمتلازمة ويليامز، وهي متلازمة حذف دقيق متكررة تتوسطها تكرارات منخفضة النسخ في المنطقة القريبة من الكروموسوم 7، تم تحديد عدم التوازن الجينومي بواسطة البرنامج بخط أحمر. يجب أن تتجمع نسبة اللوغاريتم الفلوري للبروب بشكل وثيق حول الصفر، مما يشير إلى أن نسبة اللون الأخضر إلى الأحمر هي 1:1 بالنسبة للمناطق الطبيعية من الجينوم.

قد تؤدي آثار المصفوفة المبعثرة كما هو ملاحظ في هذا المسح إلى تحديد غير دقيق للمناطق غير الطبيعية، أو الفشل في التعرف على الاختلال الجينومي، وقد يكون ذلك ناتجاً عن عدد من العوامل، بما في ذلك رداءة جودة DNA، أو وجود الأشعة، أو مستويات الأوزون في الغلاف الجوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة عينات المرضى للاختبار بواسطة A CGH وإنتاج بيانات عالية الجودة للتحليل اللاحق والكشف عن تباين عدد النسخ.