مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات
فبراير 21, 2015
حلت محل مجموعة [ك] للكشف عن الجينومية المتغيرات في عدد النسخ تحليل النمط النووي G النطاقات. وتصف هذه الورقة التكنولوجيا وتطبيقاتها في مختبر خدمة التشخيص.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تنظيم التهجين الجيني المقارن لتحديد الاختلالات في الجينوم التي يمكن أن تؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض الوراثية. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات الأولى على الحمض النووي للمريض بصبغة فلورسنت. في الخطوة الثانية ، يتم تهجين المريض ، الحمض النووي والحمض النووي المرجعي المسمى بشكل مختلف ، إلى المصفوفة.
بعد ذلك ، يتم فحص المصفوفة لقياس كمية المريض وتكثر DN المرجعي لكل مسبار. في الخطوة الأخيرة ، تتم معالجة الصورة الممسوحة ضوئيا لتحديد مناطق الجينوم حيث يحتوي الحمض النووي للمريض على مادة أكثر أو أقل من مصفوفة الحمض النووي المرجعية في النهاية. يستخدم التهجين الجيني المقارن لتحديد ما إذا كان المريض يحمل متغير رقم النسخ الذي ينتج عنه متلازمة وراثية.
يعدالعرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يمكن أن يكون تجميع شريحة المصفوفة صعبا ويسهل التهجين. امزج الانسكاب خارج الغرفة قبل البدء في تفاعل وضع العلامات. قم بإذابة صفيحة النيوكليوتيدات والبادئات الجاهزة للاستخدام 96 عند أربع درجات مئوية ومحمية من الضوء لمدة ساعة تقريبا.
بمجرد إذابتها ، قم بموازنة اللوحة المغطاة لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة ، وقم بموازنة عينات الحمض النووي لمدة 15 دقيقة عند 60 درجة مئوية في هذا الوقت أيضا. أثناء ارتفاع درجة حرارة العينات ، استخدم روبوت مناولة السوائل لتوزيع ما يكفي من الماء الخالي من النوكلياز في كل بئر من لوحة 96 بئر جديدة. ثم عندما يكون الحمض النووي جاهزا ، انقل ميكروغراما واحدا من العينة لكل بئر إلى لوح الماء 96.
الآن انقل 20 ميكرولترا من النيوكليوتيدات والبادئات المتوازنة إلى كل لوحة تحتوي على عينات الحمض النووي المخففة وأغلق اللوحة بأغطية شريطية مع الحرص على عمل ختم محكم. بعد ذلك ، قم بتغيير طبيعة الحمض النووي عند 99 درجة مئوية في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل بغطاء ساخن بعد 10 دقائق وقم بركب البرايمر عن طريق تبريد اللوحة على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم استخدم روبوت مناولة السوائل لإضافة 10 ميكرولتر من إنزيم بوليميراز الحمض النووي الخارجي النظيف إلى كل عينة.
امزج العينات بواسطة الماصة ثم أغلق اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإنهاء التفاعل بخمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتوقف لكل بئر ثم قم بإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة. انقل محتويات كل بئر إلى أنبوبين مليلتر فرديين مسبقة العلامة.
قم بتحميل العينات وأعمدة تدور تنقية الحمض النووي في روبوت معالجة عمود الدوران ، بالإضافة إلى المخازن المؤقتة المرتبطة المناسبة. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، سيقوم روبوت معالجة عمود الدوران بربط الحمض النووي المسمى بغشاء السيليكا ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط بالحمض النووي عالي الملح لكل أنبوب ، وبعد ذلك ستتم إزالة الشوائب من الأغشية بغسلتين سعة 500 ميكرولتر لكل منهما. سيضيف الروبوت بعد ذلك 15 ميكرولترا من محلول الملح المنخفض إلى الأغشية لاستعادة عينات الحمض النووي المنقاة المصنفة بأحجام تقريبية تبلغ 12 ميكرولتر لتهجين العينات.
بعد ذلك ، قم بتسخين فرن التهجين مسبقا إلى 65 درجة مئوية وقم بتسخين شرائح الدعم وغرف التهجين. لتحضير مزيج التهجين ، امزج 1.1 ميكرولتر من مهد الأطفال 1D NA 4.95 ميكرولتر من مزيج الحجب المزود بالشركة المصنعة ، و 24.75 ميكرولتر من مخزن التهجين. استخدم روبوت مناولة السوائل لتخصيص هذا المزيج في كل بئر من لوحة بئر 96 جديدة ، وترطيب كل طرف مسبقا لتعزيز دقة النقل.
الماصة التالية 9.35 ميكرولتر من التوقيع المناسب ، وثلاثة مسمى من الحمض النووي ، متبوعة ب 9.35 ميكرولتر من التوقيع المناسب ، وخمسة مسمى الحمض النووي. لكل بئر ، قم بإغلاق اللوحة ، وقم بتقطيع العينات لمدة دقيقة واحدة ، وامنح اللوحة دورانا سريعا لجمع المحتويات في الجزء السفلي من كل منها. حسنا ، قم بتغيير طبيعة الحمض النووي المسمى في حاضنة ما قبل التهجين.
أولا لمدة ثلاث دقائق عند 95 درجة مئوية ، تليها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم العمل على منصة ساخنة 42 درجة مئوية. ضع شريحة الدعم في غرفة التهجين ، مع التأكد من أن الجزء الشفاف من الحشية يتماشى مع الجزء ذو النوافذ من غرفة التهجين باستخدام أطراف مبللة مسبقا.
الآن قم ببسط 42 ميكرولترا من مزيج التهجين ببطء في وسط الموضع المناسب لشريحة دعم المصفوفة. مع الحرص على ألا يلمس السائل حدود الحلقة المطاطية. بمجرد ملء جميع المواضع ، قم بخفض شريحة المصفوفة بعناية على الشريحة الخلفية وقم بتجميع غرفة التهجين.
مع الحرص على أن يكون جانب المصفوفة مع الكتابة مواجها للشريحة الخلفية ، ثم قم بإحكام ربط برغي غرفة التهجين بالكامل وفحص غرفة التهجين المجمعة ، مع التأكد من عدم وجود تسرب للتهجين. امزج خارج حدود الحلقة المطاطية وأن يبلغ ارتفاع كل فقاعة هواء حوالي أربعة ملليمترات. عندما تستقر غرفة التهجين على نهايتها عموديا ، قم بتدوير غرفة التهجين للتحقق من ذلك.
تتحرك جميع فقاعات الهواء في كل موضع. إذا كانت أي من الفقاعات عالقة ، فامنح الغرفة نقرة حادة على المقعد. ثم ضع غرف التهجين في الفرن الدوار على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، اغمر غرف التهجين في مخزن الغسيل الأول ، واستخدم زوجا من الملقط البلاستيكي ذو الحواف المسطحة لفصل الشرائح. ثم تخلص من شرائح الحشية وضع شرائح المصفوفة في رف مغمور في مخزن مؤقت جديد. اغسل شرائح المصفوفة في حوالي 700 مل من عازلة الغسيل لمدة دقيقة إلى خمس دقائق ، مع التحريك بقوة باستخدام برغوث ونجم مغناطيسي.
ثم انقل شرائح المصفوفة إلى حوالي 700 مل من مخزن الغسيل ، اثنان لمدة 90 ثانية مع تحريك أكثر قوة في نهاية الغسيل الثاني. ارفع شرائح المصفوفة برفق خارج المخزن المؤقت. يجب أن يخرجوا جافين.
ثم قم بتحميل شرائح المصفوفة في حاملات الشرائح في الماسحة الضوئية جنبا إلى جنب مع واقيات الشرائح، ثم امسح العينات ضوئيا. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمصفوفة ، يتم تصور كل مسبار على مصفوفة مهجنة على أنه مزيج من الفلوروكروم الأحمر والأخضر. يتم تحديد نسب إشارة الفلورسنت الحمراء إلى الخضراء لكل مسبار بواسطة الماسح الضوئي ويقوم البرنامج المرتبط بها كنسبتين وفقا لموقعها الجيني.
تسمح آثار المصفوفة الناتجة بتفسير المناطق التي تم تحديدها على أنها غير متوازنة جينوما. على سبيل المثال ، في هذا التتبع من طفل مصاب بمتلازمة ويليامز ، متلازمة الحذف الدقيق المتكررة بوساطة تكرارات النسخ المنخفضة في المنطقة القريبة من الكروموسوم السابع ، تم تحديد عدم التوازن الجيني بواسطة البرنامج بخط أحمر. يجب أن تتجمع نسبة سجل الفلورسنت الدعامة عن كثب حول الصفر ، مما يشير إلى نسبة خضراء إلى حمراء من واحد إلى واحد للمناطق الطبيعية من الجينوم.
قدتؤدي آثار المصفوفة المتناثرة كما لوحظ في هذا الفحص إلى استدعاء غير دقيق للمناطق غير الطبيعية ، أو الفشل في تحديد الخلل الجيني وقد يكون ناتجا عن عدد من العوامل ، بما في ذلك ضعف جودة الحمض النووي ، أو وجود الأشعة ، ومستويات الأوزون في مجال الغلاف الجوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة عينات المرضى لاختبارها بواسطة CGH وإنتاج بيانات عالية الجودة لتحليل المصب واكتشاف تباين رقم النسخ.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة تهجين الجيل المناعي المقارن للمصفوفات (aCGH) كطريقة لاكتشاف المتغيرات العددية الجينية، والتي حلت إلى حد كبير محل تحليل الكروموسومات التقليدي المشفر بالنمط G. تهدف الإجراء إلى تحديد الاختلالات الجينية التي قد تؤدي إلى أمراض وراثية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الجينوم
- التشخيص الوراثي
- تهجين جينوم المقارن
الخلفية
- تهجين المصفوفات CGH هو تقنية حديثة لتحليل الاختلافات الجينية.
- يوفر عرضًا أكثر تفصيلًا للاختلالات الجينية مقارنة بالطرق التقليدية.
- التكنولوجيا ضرورية لتشخيص المتلازمات الوراثية.
- التسمية الفلورية للحمض النووي هي خطوة أساسية في العملية.
هدف الدراسة
- تحديد المتغيرات العددية في جينوم المرضى.
- تحسين دقة التشخيص للأمراض الوراثية.
- عرض تطبيق aCGH في بيئة المختبرات السريرية.
الطرق المستخدمة
- تسمية الحمض النووي للمريض بالأصباغ الفلورية.
- تهجين الحمض النووي للمريض والحمض النووي المرجعي في مصفوفة.
- مسح المصفوفة لقياس ارتباط الحمض النووي بالمجسات.
- معالجة الصور المسوحة لتحديد المناطق الجينية مع الاختلالات.
النتائج الرئيسية
- تحديد المناطق الجينية ذات المتغيرات العددية.
- عرض فعالية aCGH في تشخيص المتلازمات الوراثية.
- مقارنة الحمض النووي للمريض بمرجع للكشف عن الاختلالات.
- التحقق من موثوقية الطريقة في سياق التشخيص.
الاستنتاجات
- تهجين المصفوفات CGH هو أداة قوية للتشخيص الوراثي.
- تعزز التقنية فهم الأمراض الوراثية.
- تمثل تقدمًا كبيرًا مقارنة بطرق الكروموسومات التقليدية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Array CGH enables high-resolution detection of genomic copy number variants, supporting target validation in genetic disease research by providing quantitative, genome-wide imbalance data. This method enhances predictive confidence in preclinical models by identifying pathogenic variants linked to syndromes, informing mechanistic de-risking and portfolio prioritization in early discovery. Its clinical diagnostic utility translates to biomarker-aligned assay development for rare disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting pathogenic copy number variants across the genome.
- Operational Value: Provides quantitative red-to-green fluorescence ratios for precise imbalance measurement per probe.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through high-density oligonucleotide arrays targeting clinically relevant loci.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via purified, labeled DNA hybridization.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled washing, scanning, and log-two ratio analysis.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by detecting genomic imbalances that may confound phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by identifying syndromes like Williams syndrome through recurrent microdeletion detection.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation via consistent reference DNA comparison.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating genomic stability in model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical research, where genomic integrity assessment informs lead identification and disease model suitability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying copy number alterations in disease-associated genes.
- Screening: Describes assay readiness through hybridization buffer preparation and probe-level signal quantification.
- Analytics: Highlights log-two ratio outputs that enable comparison of patient versus reference DNA across genomic positions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating genomic backgrounds in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability for batch processing of patient or model system samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence imaging.
- Needs microarray scanner, liquid handling robot, and hybridization oven infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe selection, washing protocols, and ratio threshold setting.
- Requires adaptation considerations for varying DNA input quality and sample types (blood, saliva, tissue).
- Practical limitations include sensitivity to DNA purity, ozone levels, and bubble formation during hybridization.
