تظاهرة فنية من الجامعة التهجين الجينومي المقارن صفيف الجينوم
August 5th, 2008
هذا الفيديو هو تظاهرة فنية للبروتوكول لتهجين كامل الجينوم تبليط الطريق CGH الصفيف ، الذي مسح الجينوم البشري بأكمله فقط باستخدام 25-100 نانوغرام من الحمض النووي يمكن أن يكون معزولا عن مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك المواد الأرشيفية الثابتة الفورمالين.
العرض التقديمي القصير التالي هو مقطع فيديو يعرض بروتوكول التهجين لمصفوفة 27 ميجاقاعدة فرعية. تتكون هذه المصفوفة أو المصفوفة الذكية من 26،946 نسخة خلفية متسلسلة بشكل فردي مطبوعة على شريحة واحدة. يتم رصدها في نسختين ليصبح المجموع 54،000 عنصر لكل شريحة مطبوعة في منطقة 18 × 54 ملم.
البيانات الناتجة قابلة للمقارنة مع مصفوفات oligo عالية الكثافة دون الحاجة إلى تفسير البيانات بواسطة المعلوماتية الحيوية. تتمثل إحدى الميزات الرئيسية لاستخدام مصفوفة إدراج كبيرة مثل المستنسخة الخلفية في أنها تسمح باستخدام أقل من 100 نانوجرام من عينة الحمض النووي دون تضخيم. يسمح ذلك بتحليل مجموعة متنوعة من العينات مثل الحمض النووي من الأنسجة المجمدة في الدم والخلايا المصنفة ومادة FFPE.
أثبتت المصفوفة الذكية فائدتها في البيئة السريرية. في وكالة كولومبيا البريطانية للسرطان ، يمكن بسهولة استيعاب تحليل عينات المرضى المتعددة في متوسط أسبوع العمل. لعلم الوراثة الخلوية.
معظم الخطوات المستخدمة في المصفوفة CGH تشبه CGH التقليدية أو الأسماك. السماح بالإدخال السريع للبروتوكول في المختبرات القائمة. جودة الحمض النووي هي التأثير الأكبر على النتائج في المصفوفات.
سيؤثر تهجين CGH أو الجودة الرديئة أو الحمض النووي الملوث سلبا على دمج PSI في المنتج مما يؤدي إلى صور خافتة أو ضوضاء في البيانات. يعد مقياس الطيف الضوئي NanoDrop أداة ممتازة لتقييم جودة الحمض النووي قبل التهجين. لتقدير مجموعة الحمض النووي ، فإن NanoDrop لقياس الحمض النووي ووضع قياس الحمض النووي 50 فارغا ، و NanoDrop مع 1.5 ميكرولتر من نفس المحلول مثل العينة المعلقة.
في هذه الحالة ، هو الماء تريس. وقد ثبت أن EDTA لها آثار سلبية محتملة على تأسيس PS D. قم بإزالة المنديل الفارغ بمنديل Kim وأضف 1.5 ميكرولتر من مقياس العينة وسجل تركيز العينة.
تعد القراءة 60 على اثنين 80 على NanoDrop مؤشرا جيدا لجودة الحمض النووي حيث تكون نسبة 1.8 هي الأمثل. توفر طريقة النسبة المزدوجة اثنان 60 على اثنين 80 واثنان 60 على اثنين 30 طريقة أفضل لتحديد نقاء عيناتك. يعرض NanoDrop منحنى يمثل الامتصاص بالنسبة للطول الموجي.
يشير المنحنى السلس الذي لا يحتوي على قمم إلى مسح الحمض النووي عالي الجودة وتنظيف NanoDrop بالماء ومسح كيم ، أو إذا كانت العينة محدودة ، فقم بإخراج العينة من قاعدة التمثال. تم تحسين هذا البروتوكول لما بين 100 إلى 400 نانوغرام من العينة. 200 نانوجرام هي الكمية المستهدفة للحمض النووي عالي الجودة لتسمية العينة ، يلزم وجود الكواشف والمعدات التالية.
عازلة SCI ثلاثة SCI خمسة ERs عشوائية 10 مرات DNTP مزيج مرجعي للحمض النووي ماء معقم 0.2 ميكرولتر أنابيب PCR معقمة كتلة حرارية للثلج عند 100 درجة مئوية حاضنة عند 45 درجة مئوية. قم بإعداد أنبوب تفاعل واحد للحمض النووي المرجعي وأنبوب تفاعل واحد. بالنسبة لعينة الحمض النووي ، سيتم تصنيفها بالخيال العلمي و SCI ثلاثة على التوالي.
في بيئة البحث ، نفضل استخدام CY three لعينة الحمض النووي لدينا لأنه أكثر مقاومة لتدهور الأوزون. اجمع بين الحمض النووي والماء والقناة المخزن المؤقت للعينة وكرر ذلك للحصول على الحمض النووي المرجعي. في مختبرنا ، نجمع بين المخزن المؤقت 10 مرات مع Optimus العشوائي.
لإنشاء محلول خمس مرات ، أضف الماء المعقم إلى الحجم الإجمالي البالغ 17 ميكرولترا. انقل الأنابيب إلى كتلة حرارية ، وقم بتغيير طبيعتها لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية. انقله على الفور إلى الثلج.
أضف أربعة ميكرولترات من مزيج DNTP 10 أضعاف. أضف العيون الجانبية. أضف ميكرولترين من SCI ثلاثة تسمى DCTP لأخذ عينات من الحمض النووي.
أضف ميكرولترين من علم العلوم المسمى DCTP للإشارة إلى الحمض النووي. أضف 2.5 ميكرولتر من القناة واخلطها. يمكن أن يكون المحلول إما مختلطا يدويا أو دوامة.
قمبتدوير المحلول لفترة وجيزة إلى أسفل الأنبوب بنبض سريع في جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي. انقله إلى الفرن واحتضنه على حرارة 37 درجة طوال الليل. يمكن تعديل وقت التهجين بين عشية وضحاها بين 14 إلى 24 ساعة دون التأثير سلبا على عملية وضع العلامات.
لتناسب جدول المختبر باستخدام عمود MicroCon YM 30 ، أضف 100 ميكرولتر تم اصطياده 1D NA إلى العمود. احرص على عدم لمس الغشاء بطرف ماصة تم التقاط. من المعروف أن تباين الحمض النووي من دفعة إلى دفعة يحدث حتى عند شرائه من الموزعين الرئيسيين.
يوصى بشراء دفعات كبيرة واختبارها قبل الاستخدام. سيكون هناك الآن أنبوبان لكل عينة تهجين ، أحدهما أزرق اللون والآخر أحمر اللون. امزج الأنابيب لكل عينة واخلطها عن طريق سحب العينات.
ثم انقل المحلول بالكامل إلى غشاء MicroCon. ضع العمود في أنبوب MicroCon المرفق وقم بالدوران عند 13,000 جم لمدة 10 دقائق. عمود MicroCon عبارة عن عمود استبعاد للحجم وسيحبس الحمض النووي بالأصباغ الجانبية المدمجة ويسمح للأصباغ غير المدمجة بالغسل من خلال الغشاء.
لغسل أي نيوكليوتيدات أو جانب متبقي غير مدمج ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى الغشاء. تدور مرة أخرى عند 13،000 جم لمدة 10 دقائق. تخلص من الأنبوب وأضف 45 ميكرولترا من محلول التهجين إلى الجزء العلوي من عمود مكثف MicroCon.
حل التهجين الذي نستخدمه هو Dig Easy من Roche Scientific يمكن أيضا إضافة خمسة ميكرولترات من المنوية المشتركة للرنجة إلى المحلول. تقليديا ، تم استخدام هذا لمنع الارتباط غير التنافسي بسطح الشريحة. سمح ظهور مواد ملزمة جديدة بالقضاء على هذه الخطوة.
ومع ذلك ، يتم إضافته أحيانا لزيادة لزوجة محلول التهجين. اقلب عمود MicroCon وضعه في أنبوب جديد مسمى. قم بتدوير الأنبوب عند 3000 جم لمدة ثلاث دقائق.
سوف يتجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب الجديد. سيتم استخدام 1.5 ميكرولتر من المحلول لقياس القياس الكمي لتأسيس SD. اضبط NanoDrop على تحليل المصفوفة الدقيقة ، فارغة.
NanoDrop مع 1.5 ميكرولتر من الحفر. عازلة تهجين سهلة. قم بقياس الفراغ باستخدام NanoDrop.
يجب أن تكون القراءة صفرا. قم بإزالة المنديل الفارغ بمنديل كيم وأضف 1.5 ميكرولتر من مقياس العينة الخاص بك وسجل دمج العينة الخاصة بك. سيمنحك NanoDrop شامة PICA لكل تركيز ميكرولتر لكل من S3 وصبغة الخيال العلمي التي تتضمن عينات مع الدمج أدناه.
يجب اعتبار ثلاثة أوليات لكل ميكرولتر تحتوي على عدد قليل جدا من الفلور أربعة للمتابعة ، سيعرض NanoDrop رسما بيانيا للامتصاص مقابل الطول الموجي. يجب أن تكون قمتان مرئيتين ، واحدة لكل من العينين الجانبية تمسح وتنظف NanoDrop بالماء ومسح كيم. ضع الغطاء زلق على جهاز تسخين منزلق أو كتلة حرارية دافئة مسبقا إلى 45 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة التهجين.
ضع 42 ميكرولترا من محلول المسبار على زلة الغطاء مقاس 22 ملم × 60 ملم. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في المحلول. الحيلة السريعة لإزالة الفقاعة العنيدة هي أخذ زلة غطاء جديدة وتفجير الفقاعة بزاوية حادة.
قم بمحاذاة الشريحة فوق زلة الغطاء ومحلول المسبار. قم بخفض حافة واحدة من الشريحة ، مما يسمح بالاتصال بمحلول التهجين. استمر في خفض حافة واحدة حتى تلتصق زلة الغطاء بالشريحة مع شد السطح.
عكس الشريحة. ضع الشريحة في شريط تهجين ، وقم بالتسخين المسبق إلى 45 درجة مئوية ، وأضف 10 ميكرولتر من الماء في الأخدود السفلي للتحكم في الرطوبة. يجب ممارسة هذه الخطوة حيث يتبلور الحفر بسهولة في درجات حرارة منخفضة وسيترك خلفية على الشريحة.
هذا مهم بشكل خاص عندما يكون المحلول على الشريحة لأنه طبقة رقيقة جدا من السائل. في هذه المرحلة ، أغلق الكاسيت واحتضنه لمدة 36 إلى 40 ساعة عند 45 درجة مئوية. إزالة الشريحة من كاسيت التهجين أمر بالغ الأهمية.
حفر ، يتبلور بسهولة في درجة حرارة الغرفة. يجب غمر الشريحة على الفور وإزالة زلة الغطاء في محلول الغسيل. يجب أن تكون جميع محاليل الغسيل معدة مسبقا وأن يكون لها درجة حموضة سبعة درجة حموضة غير محايدة قد تؤدي إلى تدهور العينين الجانبية.
قم بتسخين محلول الغسيل إلى 45 درجة مئوية. أضف ما يقرب من 60 مل من محلول الغسيل إلى برطمان كوبلاند قبل فتح غرفة التهجين. افتح الغرفة.
قم بإزالة الشريحة بالملاقط وأضف الشريحة إلى محلول الغسيل. مع استمرار تثبيت زلة الغطاء ، انتظر من 10 إلى 20 ثانية واسترجع زلة الغطاء باستخدام الملقط. كان يجب أن يسقط من الشريحة.
هذه خطوة مهمة لأنها تمنع المخزن المؤقت السهل للحفر من التبلور بالإضافة إلى تقليل أي خدش محتمل للشريحة عن طريق الإزالة الميكانيكية لانزلاق الغطاء. اغسل الشريحة ثلاث مرات في محلول الغسيل. دقيقة واحدة مع كل منهما مع الانفعال.
اشطف الشريحة ثلاث مرات. يجب ألا يكون هناك فقاعات متبقية من SDS في محلول الغسيل المرئي بعد الغسيل الأخير. اترك الشريحة في محلول الغسيل حتى تصبح جاهزة لجهاز الطرد المركزي.
جهاز طرد مركزي في أنبوب فالكون سعة 50 مليلتر عند 700 جم لمدة دقيقة واحدة. تأكد من جفاف أنبوب فالكون قبل الاستخدام. امسح الشريحة ضوئيا على الفور حيث ستتضاءل شدة الإشارة بمرور الوقت.
اعتمادا على مستويات الأوزون المحيطة ، يختلف كل ماسح ضوئي ، ولكن هناك بعض الإرشادات الشائعة التي يجب اتباعها. لتصوير الشرائح. مستويات الأوزون المحيطة أمر بالغ الأهمية أثناء عملية المسح.
قالب الخيال العلمي حساس للأوزون وسوف يتحلل بسرعة خلال فترة المسح الطويلة. لقد ثبت أن خمسة أجزاء لكل مليار من الأوزون تؤثر على S خمسة. هذا يعادل التلوث المروري الخفيف في يوم صاف.
يوصى باستخدام عدادات الأوزون لتسجيل مستويات الأوزون المحيطة. يتم إنشاء صورة منفصلة لكل قناة S3 و SCI خمسة. يمكن موازنة القنوات عن طريق تغيير حساسية التعرض أو الوقت أو الإثارة أو الإدخال أو الالتقاط للماسح الضوئي.
هذه الصور جاهزة الآن للتحليل.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يوضح هذا الفيديو بروتوكول التهجين لمصفوفة مسار تغطية الجينوم الكامل CGH، مما يمكن مسح الجينوم البشري بالكامل مع الحد الأدنى من مدخلات الحمض النووي. تتيح الطريقة تحليل أنواع مختلفة من العينات، بما في ذلك المواد الأرشيفية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الجينوم
- تحليل الحمض النووي
- تقنيات التهجين
الخلفية
- تتكون المصفوفة من 26,946 نسخ خلفية متسلسلة بشكل فردي.
- تحتوي كل شريحة على إجمالي 54,000 عنصر.
- البيانات التي تم الحصول عليها قابلة للمقارنة مع المصفوفات الأوليجونوكليوتيد عالية الكثافة.
- لا يلزم تفسير المعلومات الحيوية لتحليل البيانات.
هدف الدراسة
- لتوضيح بروتوكول التهجين لمسح الجينوم.
- لاستخدام عينات الحمض النووي الدنيا لتحليل جينوم شامل.
- لتسهيل استخدام أنواع مختلفة من العينات في الدراسات الجينومية.
الطرق المستخدمة
- بروتوكول التهجين لمصفوفة مسار تغطية الجينوم الكامل CGH.
- استخدام 25-100 نانوجرام من الحمض النووي من مصادر مختلفة.
- تطبيق النسخ الخلفية المنقوشة بشكل مكرر على الشرائح.
- تحليل العينات بدون تضخيم.
النتائج الرئيسية
- مسح ناجح للجينوم البشري بمدخلات منخفضة من الحمض النووي.
- القدرة على تحليل الحمض النووي من الدم والأنسجة المجمدة ومواد FFPE.
- جودة البيانات قابلة للمقارنة مع المصفوفات عالية الكثافة.
- تحليل ميسر بدون متطلبات واسعة لعلم المعلومات الحيوية.
الاستنتاجات
- بروتوكول التهجين فعال للتحليل على مستوى الجينوم.
- متطلبات الحمض النووي الدنيا توسع نطاق أنواع العينات.
- تعزز هذه الطريقة من إمكانية الوصول للبحوث الجينومية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Array CGH enables genome-wide detection of DNA copy number alterations with minimal input, supporting target validation in oncology and genetic disease research. The method reduces dependency on bioinformatics expertise while maintaining data quality comparable to high-density arrays. This facilitates broader adoption in discovery pipelines where sample scarcity and heterogeneity are common challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic alterations across the whole genome to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Works with as little as 25-100 ng of unamplified DNA, allowing use of precious or archival samples.
- Predictive Value: Detects alterations as small as 50 kb, providing resolution for early-stage mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative log2 ratio data at each BAC target for objective comparison of sample and reference genomes.
- Operational Value: Uses SeeGH software to process 53,892 data points per experiment, standardizing output for downstream analysis.
- Reproducibility: Duplicate spotting of BAC clones enhances signal reliability and reduces technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Compatible with FFPE DNA, enabling use of clinically relevant, archival patient samples.
- Tissue Heterogeneity Tolerance: Large BAC insert size reduces need for microdissection, supporting analysis of complex tissue samples.
- Preclinical Modeling: Detects DNA gains, losses, amplifications, and homozygous deletions relevant to disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly when genomic alterations inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening for copy number changes linked to oncogenes or tumor suppressors.
- Analytics: Produces chromosomal position-aligned log2 ratios that enable visual and quantitative assessment of genomic instability.
- Enterprise Reuse: Protocol is standardized and reusable across labs, with minimal need for specialized bioinformatics support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution detection of DNA alterations aids in target confidence and pathway clarification.
- Operational Value: Low DNA input and tolerance for impure samples increase accessibility and reduce preprocessing burden.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on genomic profiles without requiring sequencing infrastructure.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets with validated genomic alterations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence detection.
- Dependent on hybridization cassettes, temperature-controlled incubators, and microarray scanners.
- NanoDrop quantification is essential for assessing DNA quality and dye incorporation efficiency.
- Protocol optimization needed for varying sample types, including FFPE and low-input materials.
- Ambient ozone levels must be monitored during scanning to prevent Cy5 dye degradation.
![ميكروأرس] DNA : نموذج مراقبة الجودة ، وتهجين صفيف والمسح الضوئي](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F2546.jpg%3Fv%3D2026-07-02T20%253A49%253A12.000Z&w=384&q=75)
![مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F51718.jpg%3Fv%3D2026-07-03T07%253A27%253A51.000Z&w=384&q=75)
