استقرار الكبدي النمط الظاهري عن طريق الأسطح الاصطناعية محسن

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين الأسطح المطلية بالبوليمر للحفاظ على استقرار المزارع طويلة الأمد للخلايا الكبدية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تخليق البولي يوريثان 1 3 4 أو PU 1 3 4، ثم تلي ذلك خطوة اختيار المذيب المناسب لإذابة PU 1 34.

بعد ذلك، يتم تحسين عملية الطلاء الدوراني باستخدام PU 1 3 4 على شريحة الغطاء الزجاجية. وتتمثل الخطوة النهائية في تحسين إجراء التعقيم لشرائح الغطاء الزجاجية المطلية بالبوليمر P 1 34، وفي النهاية يتم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح، ومجهر القوة الذرية، ومقايسات استقلاب الأدوية لإظهار تأثير طلاء بوليمر PU 1 34 على وظيفة الخلايا الكبدية المشتقة من الخلايا الجذعية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام المصفوفات في المزارع الخلوية للحفاظ على الخلايا الجذعية القوية في URI والتي تحتوي على خلايا كبدية، في إمكانية ضبط هذه المواد الاصطناعية بدقة لتناسب الغرض المطلوب وإنتاجها بمقاييس تتوافق مع معايير ضمان الجودة. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تظهر اتساقاً بين الدفعات الإنتاجية. وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاج أمراض الكبد لأنها تمثل نموذجاً لكيفية تحسين سطح البوليمر الاصطناعي للحفاظ على النمط الظاهري للخلية.

سيقوم الدكتور Jeffrey Walton، وهو باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراه من مختبري، بشرح الإجراء. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتطبيق معالجة حرارية لكل من mono's one six hexane dial di ethylene glycol و neo PenTile glycol عند 40 °C لمدة 48 ساعة في فرن تفريغ. لإزالة أي مياه متبقية، أضف 22 millimoles من كل مونومر و 55 millimoles من dpic acid إلى دورق مستدير القاع ذي عنقين متصل بجهاز Dean Stark ومزود بقضيب تحريك مغناطيسي.

بعد ذلك، ضع المجموعة بأكملها تحت تفريغ هوائي وسخن الأواني الزجاجية بلطف عند 40 °C لمدة ست ساعات لتجنب أي امتصاص للرطوبة أثناء إضافة المادة الكيميائية إلى الدورق. بعد إخراج المجموعة من الفرن ووضع النظام تحت غاز النيتروجين، أضف 0.0055 moles من المحفز titanium four, but oxide قطرة تلو الأخرى إلى الدورق باستخدام حقنة. قم بتقليب خليط التفاعل عند 180 °C لمدة 24 ساعة، مع تجميع المياه المتبقية في مصيدة Dean-Stark.

اترك المنتج ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اخلط 3.2 millimole، أو مكافئ واحد من polyol P-H-N-G-A-G مع 6.4 milli mole أو مكافئين من four four methyl and a bisphenol isocyanate في 12 milliliters من anhydrous DML في دورق مستدير القاع ذي عنقين متصل بجهاز Dean-Stark ومزود بقضيب تحريك مغناطيسي.

قم بتقليب خليط التفاعل عند درجة حرارة 70 °C تحت جو من النيتروجين. ثم أضف المحفز titanium four oxide قطرة تلو الأخرى بواسطة حقنة وصولاً إلى تركيز نهائي قدره 0.8%. بعد مرور ساعة واحدة، أضف مكافئاً واحداً من ممدد السلسلة one four butane dial للحصول على منتج البوليمر المشترك. ارفع درجة الحرارة إلى 90 °C واترك التفاعل لمدة 24 ساعة تحت جو من النيتروجين.

بمجرد وصول خليط التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة، يُضاف الإيثر قطرة تلو الأخرى إلى الخليط حتى يُلاحظ ترسيب منتج البولي يوريثين. بعد نقل خليط التفاعل إلى أنبوب طرد مركزي، يتم تدوير المحلول بجهاز الطرد المركزي عند 5,300 ×g لمدة خمس دقائق. بعد سحب الراشح، يُترك الراسب ليجف في درجة حرارة الغرفة حتى يتبخر المذيب.

بعد ذلك، قم بوزن 200 milligrams من PU 1 34 ووضعها في زجاجة زجاجية. خفف العينة لتصل إلى تركيز نهائي قدره 2% في الكلوروفورم، أو خليط من الكلوروفورم والتولوين بنسبة واحد إلى واحد، أو التيتراهيدروفوران، أو مزيج من التيتراهيدروفوران والكلوروميثان بنسبة واحد إلى واحد. رُج المحلول بقوة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز رجّ بسرعة 200 حركة في الدقيقة حتى يصبح المحلول متجانسًا ولا يُلاحظ وجود أي راسب.

عند الانتهاء، ضع غطاءً زجاجياً مربعاً بحجم 15 millimeter تقريباً على جهاز الطلاء الدوراني. أضف 50 µL من محلول PU one through four إلى الغطاء الزجاجي باستخدام ماصة، ثم قم بتدوير كل غطاء زجاجي لمدة سبع ثوانٍ عند 23 ×g. بعد ذلك، اترك الغطاء الزجاجي ليجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التعقيم. في هذه المرحلة، قم بتعريض كل غطاء زجاجي مطلي بالبوليمر لإشعاع غاما بتطبيق جرعة قدرها 10 grays باستخدام جهاز إشعاع مختبري لمدة 12 دقيقة.

وبدلاً من ذلك، يتم تعريض كل شريحة غطاء مغلفة بالبوليمر للإشعاع فوق البنفسجي باستخدام مصباح UV بقدرة 30 وات لمدة 16 دقيقة على كل جانب. وعند الانتهاء، توضع الشريحة المغلفة بالبوليمر في طبق زراعة أنسجة مناسب وفقاً لحجم شريحة الغطاء. بعد زراعة وتمايز خط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، يتم فصل الخلايا باستخدام كاشف تفكيك وإعادة زرعها على شرائح الغطاء المغلفة بـ PU 1 34 في اليوم التاسع من عملية التمايز في وجود وسط خالٍ من المصل، ثم يتم الفحص بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح.

تُظهر صور شرائح الغطاء الزجاجية المختلفة المطلية أن الطلاء باستخدام التولوين أو الكلوروفورم لم يكن متجانساً، مما يشير إلى طلاء غير منتظم مع ترسب PE 1 34. وفي المقابل، سمح رباعي هيدرو الفوران (tetrahedran) بالطلاء الدوراني لسطح أكثر انتظاماً بكثير. بالإضافة إلى ذلك، يُظهر تحليل مجهر القوة الذرية لطلاءات البوليمر المختلفة انخفاضاً بنسبة 40% في خشونة P 1 34 المذاب في tetra hydro furin مقارنة بالمذيبات الأخرى، مما يدل على طلاء PU 1 34 أكثر انتظاماً. وفي تطبيق بيولوجي، تم تحفيز تمايز الأديم الباطني الكبدي، وفي اليوم التاسع، ظهرت خلايا شبيهة بآرومات الكبد، حيث عبرت غالبية الخلايا عن cytokeratin 19 و alpha feta protein و hepatocyte nuclear factor for alpha، مع مستويات منخفضة من albumin كمقياس للوظيفة الأيضية.

تم تقييم وظيفة Cytochrome P450 بعد أربعة أيام من إعادة الزرع على أسطح مختلفة مطلية بالبوليمر. لوحظت زيادة بمقدار ضعفين في النشاط الأيضي للخلايا التي أعيد زرعها على أسطح مطلية بـ tetra hydro fure mpu 1 3 4. وتظهر هذه النتائج أن النشاط الأيضي للخلايا الكبدية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية يتحسن مع طلاء P 1 34 أكثر تجانساً. ولم يظهر التصوير التبايني أي فروق كلية بعد التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية أو أشعة غاما، وهو ما تم تأكيده لاحقاً من خلال تحليل المجهر الإلكتروني الماسح.

أظهرت الخلايا الكبدية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، والتي أُعيد زرعها على شرائح زجاجية مغطاة بـ PU 1 34 المعرض للإشعاع غاما، زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف في نشاط CYP three a مقارنة بالخلايا التي أُعيد زرعها على شرائح زجاجية مغطاة بـ PU 1 34 المعرض للإشعاع فوق البنفسجي. وتثبت هذه الملاحظات أن الإشعاع غاما هو تقنية التعقيم المثلى. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحقق من تجانس الطلاء بين مختلف شرائح الزجاج المستخدمة في طلاء الدوران، ولا تنسَ أن العمل مع أدوات المذيبات الكيميائية قد يكون خطيراً للغاية.

يجب دائمًا اتخاذ تدابير السلامة، مثل ارتداء نظارات واقية، عند تنفيذ هذا الإجراء.