في المختبر توليف التعديل مرنا للتحريض التعبير البروتين في الخلايا البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التخليق في المختبر ل mRNA المعدل لتحريض التعبير عن البروتين في الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضخيم إدراج البلازميد أولا أو تسلسل الحمض النووي المشفر وإضافة ذيل بولي تي من 120 ثيميدين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. الخطوة الثانية هي النسخ في المختبر للحمض النووي المتولد إلى mRNA باستخدام ذيول بولي الأدينين.

بعد ذلك ، تتم إزالة الحمض النووي للقالب عن طريق معالجة D'S لخليط تفاعل النسخ في المختبر. الخطوة الأخيرة هي معالجة الفوسفاتيز في القطب الجنوبي لل mRNA المنتج لإزالة خمسة فوسفات رئيسي. في النهاية ، يتم نقل الخلايا بواسطة mRNA المتولد ، المجمعات الدهنية.

يستخدم الفحص المجهري الفلوري وتحليل قياس التدفق الخلوي لإظهار تخليق GFP المعزز في الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الترانسفيكت الفيروسي ، هي عدم الاندماج في جينوم الخلية المضيفة ، مما يمنع خطر تكوين الأورام. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في إنتاج البروتينات المفقودة أو المعيبة في الخلايا ويمكن استخدامها للتطعيم والعلاج من الاضطرابات الوراثية.

وفي مجال الطب التجديدي ، سيكون إثبات الإجراء طالب دراسات عليا من مختبري. قبل بدء هذا الإجراء ، تم تضخيم البلازميدات التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي الترميز المطلوب أو CDS في الإشريكية القولونية وعزلها كما هو موضح في نص البروتوكول. في هذا المثال ، يتم تعزيز CDS محل الاهتمام بالبروتين الفلوري الأخضر أو EGFP لتضخيم وإضافة تفاصيل بولي في نفس الوقت إلى CDS الخاص ب EGFP.

قم بإعداد خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو مفصل في نص البروتوكول. ضع أنبوب PCR في جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل بروتوكول تدوير تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضح في نص البروتوكول. عند اكتمال تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتنظيف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية PCR المتوفرة تجاريا وقم بتخفيف الحمض النووي باستخدام 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز.

للتحقق من جودة منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي وتصور نطاقات الحمض النووي على نظام التصوير. يجب الكشف عن نطاق DNA واضح بطول 1 ، 100 زوج أساسي تقريبا أثناء النسخ في المختبر أو IVT. سيتم نسخ الحمض النووي الذي تم إنشاؤه مسبقا إلى mRNA.

تحضير الخليط التناظري لغطاء NTP كما هو موضح هنا. امزج الخليط التناظري لغطاء NTP جيدا عن طريق الدوامة. ثم قم بتدويرها لأسفل قم بتجميع خليط تفاعل IVT لفترة وجيزة كما هو موضح في هذا الجدول.

امزج خليط تفاعل IVT جيدا عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل. ثم قم بالطرد المركزي لأنبوب PCR لفترة وجيزة لجمع الخليط في قاع الأنبوب. احتضان خليط تفاعل IVT عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات في الخلاط الحراري.

بعد ثلاث ساعات ، قم بإزالة قالب الحمض النووي عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من الحمض النووي إلى خليط تفاعل IVT. خلطها جيدا وتحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بتنقية خليط التفاعل باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي وقم بتخفيف MR NA المعدل من غشاء عمود الدوران مرتين باستخدام 40 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، ويجب معالجة mRNA المعدل الناتج عن IVT بالفوسفاتيز لإزالة خمسة فوسفات ثلاثي رئيسي ، مما قد يؤدي إلى تنشيط المناعة.

لبدء هذا الإجراء ، أضف تسعة ميكرولترات من 10 × محلول تفاعل الفوسفاتيز في القطب الجنوبي إلى 79 ميكرولترا من محلول mRNA المنقى. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من فوسفاتيز القطب الجنوبي واخلط العينة برفق. احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، قم بتنقية خليط التفاعل باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي وقم بتخفيف mRNA المعدل من غشاء عمود الدوران مرتين باستخدام 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. بعد قياس تركيز الرنا المرسال المعدل ، اضبط التركيز على 100 نانوجرام لكل ميكرولتر عن طريق إضافة الماء الخالي من النوكلياز. تحقق من جودة الرحل الكهربائي لجل الحمض النووي الريبي المعدل المركب وتصور حظر السلم والحمض النووي الريبي المرسال على مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

يجب الكشف عن نطاق mRNA واضح بطول 1 ، 100 زوج أساسي تقريبا. قم بإعداد خلايا HEC 2 9 3 للتعداء باستخدام mRNA المعدل المركب عن طريق الطلاء مرتين. قم بتوسيط الخلايا الخمس لكل بئر من صفيحة 12 بئر تحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة خلية في اليوم التالي ، يجب أن تصل الخلية إلى 80 إلى 90٪ التقاء.

توليد الضفيرة الدهنية للتعداد. قم بإعداد خليط تعداء كاف لجميع الآبار المراد نقلها ، يتطلب كل بئر من صفيحة 12 بئرا 2.5 ميكروغرام من mRNA المعدل ، ولترين ميكرولترين من كاشف تعداء الدهون و 473 ميكرولتر من الاختيار الأول. تقليل وسط السيروم.

امزج المكونات برفق عن طريق سحب العينة كعنصر تحكم سلبي. قم بإعداد خليط تعداء بدون Mr.NA ، واحتضان مخاليط التعدي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتوليد ضفيرات الدهون. للتعداد.

اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من DPBS لكل من. حسنا ، أضف 500 ميكرولتر من خليط التعداء إلى كل بئر من صفيحة 12 بئر ، واحتضن الخلايا لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد أربع ساعات ، واستنشق خليط التعداء وأضف ملليلتر واحد من ثقافة الخلايا الكاملة. متوسطة للخلايا في كل بئر.

احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة الخلية. بعد ذلك ، قم بإجراء تحليل مجهري مضان للخلايا باستخدام مجهر مضان لإعداد الخلايا لقياس التدفق الخلوي. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من الآبار واغسل كل بئر بواحدة من DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.

أضف 500 ميكرولتر من TRIPSIN EDTA لكل بئر لفصل الخلايا عن سطح ألواح زراعة الخلايا. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول تحييد التربسين لكل بئر لتعطيل الطرد المركزي للخلايا المنفصلة لمدة خمس دقائق عند 300 مرة من درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة ريس السوبينات ، قم بتعليق حنك الخلية في 150 ميكرولتر من محلول تثبيت الخلية وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي.

تحليل النسبة المئوية للخلايا التعبيرية عن EGFP وشدة التألق باستخدام المتوسط الهندسي لشدة الفلورة. يتم أيضا تقييم تعبير البروتين بمرور الوقت عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا التي تعبر عن EGFP بعد يوم واحد ويومين وثلاثة أيام بعد التعداء كما هو موضح في نص البروتوكول ، تم اختبار وظيفة EGFP mRNA الذي تم إنشاؤه عن طريق تعداء خلايا HEC 2 9 3. تم الكشف عن إنتاج EGFP في الخلايا بعد 24 ساعة من التعدي باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

هنا ، تظهر صورة تباين الوجه للخلايا بجوار صورة مضان للخلايا. تم الكشف أيضا عن تعبير EGFP في الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 24 ساعة من التعدي. يمثل الخط الوردي الخلايا التي لا تحتوي على mRNA ، وتعداء ، ويمثل الخط الأزرق الخلايا الموجبة ل EGFP.

بعد تعداء EGFP mRNA ، كان 93.91٪ من جميع الخلايا المقاسة إيجابيا ، وكان المتوسط الهندسي لشدة التألق 720.16. تم تقييم مدة التعبير عن البروتين في خلايا HC 2 93 عن طريق قياس تعبير EGFP بعد يوم ويومين وثلاثة أيام من mRNA. كان تعبير بروتين التعدي أعلى في الخلايا بعد 24 ساعة من التعدين.

تم تخفيض الكمية بمقدار 1.6 ضعف كل يوم بعد ذلك ، ولكن حتى بعد ثلاثة أيام ، احتوت الخلايا على EGFP بمجرد إتقانها. يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج MRNA المعدل المستقر لتحريض التعبير البروتيني المطلوب في الخلايا.