وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

الهدف العام من التجارب التالية هو تسمية الحمض النووي والبروتينات على وجه التحديد باستخدام ترانسفيراز الميثيل ، والتي تنقل بشكل طبيعي مجموعة الميثيل المنشطة والعامل المساعد Sile l methionine المسمى aome إلى D-N-A-R-N-A. البروتينات أو الجزيئات الحيوية الصغيرة. يتم تحقيق وضع العلامات بخطوة واحدة عن طريق استبدال العامل المساعد الطبيعي الذي يتم حذفه بعوامل مساعدة اصطناعية للعين التي تغير مسار التفاعل مما يؤدي إلى اقتران إنزيمي للعامل المساعد بأكمله وبالتالي وضع العلامات التساهمية لتسلسل الركيزة يتم عرض وضع العلامات الناجمة عن نقل الميثيل المحدد للحمض النووي مع ترانسفيراز ميثيل الحمض النووي الخاص بالأدين ، M-B-S-E-C ONE ، الذي يجمع بين العامل المساعد للبيوتينيل Aine ستة BAZ بتسلسل التعرف على A-G-C-G-A-T الذي يؤدي إلى التسلسل ، على وجه التحديد البيوتينيل ، النقل الموجه لميثيل الحمض النووي للمجموعات المنشطة هو استخدام بروتين الملصق ويتم توضيحه باستخدام MTAs مجموعة سبعة تسعة ، والتي تنقل مجموعة pro pargo من C ثمانية oin إلى lysine four من histone H ثلاثة.

يتم تمييز بقايا اللايسين المؤلكل كيميائيا بواسطة فلور معدل azi باستخدام كيمياء النقر المحفز بالنحاس ، مما يؤدي إلى بروتين مصنف على وجه التحديد. تتمثل إحدى مزايا استخدام ترانسفيراز الميثامفيتامين لوضع العلامات في أن لديها القدرة على استهداف الركائز الأصلية مباشرة. سأشرح ذلك من خلال ابتهاج bioTE الخاص بالتسلسل للبلازميد ، وترانسفيراز الحمض النووي ميث ، وتعديل البروتين المحفز باستخدام العامل المساعد التناظري zin ويتيح إدخال مجموعة متنوعة من مجموعات المراسلين في خطوتين.

سأشرح ذلك من خلال وضع العلامات الفلورية على البروتين hisone H three وإظهار النتائج من تسمية H ثلاثة بالبيوتين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصنيع نظائر التشغيل المساعد المنشط المزدوج بسهولة عن طريق تحميل S ail ، el homocysteine ، منتج العامل المساعد بعد نقل مجموعة الميثيل مع العديد من الكحوليات المنشطة. يتم تنقية نظائر العامل المساعد الاصطناعية عن طريق HPLC في الطور العكسي ، وفي بعض الحالات من الممكن فصل epi المريخ عند الكبريت.

الحمض النووي المبتسم هو وضع العلامات الناجم عن ترانسفيراز الميثيل الخاص بالتسلسل للحمض النووي. هنا يتم توضيح المفهوم من خلال تسمية PB 3 22 البلازميد DNA بستة عامل مساعد BAZ Aine ، وترانسفيراز ميثيل الحمض النووي الخاص بالأدين. يبدأ M-B-S-E-C بتحريك الستة BAZ عند 20 درجة مئوية.

بمجرد التفكير ، قم بإصلاح خليط التفاعل على الجليد. يتضمن ميكروغراما من البلازميد ، و 60 ميكرومولار من ستة BAZ ، و 10 ما يعادل M-B-S-E-C واحد. تسلسل التعرف على HER على الحمض النووي في المخزن المؤقت للتعديل.

تأكد من إضافة ستة BAZ و M-B-S-E-C أخيرا. تأكد من عدم وجود AME مرتبط بترانسفيراز الميثامفيتامين الذي تستخدمه لأن العامل المساعد الطبيعي سيمنع وضع العلامات. رد فعل لعناصر التحكم.

استبدل MTAs بالماء لتصور أي تعديلات غير محددة على العامل المساعد وأضف الماء بدلا من العامل المساعد لاختبار العامل المساعد الطبيعي في تركيز الإنزيم. الآن امزج التفاعلات برفق باستخدام ماصة واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة. قرب نهاية الحضانة ، قم بإصلاح خليط نوكلياز داخلي على الجليد عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 10 × تاك مؤتلف ، ومخزن مؤقت واحد إلى 80 ميكرولتر من الماء ، ثم إضافة 3.3 ميكرولتر من نوكلياز المؤتلف الخاص بتقييد واحد.

بعد الحضانة ، اسحب التفاعلات بدوران سريع ثم تحقق من تعديل الحمض النووي لكل منها. أضف ميكرولترين من 10 × tak ، ومخزن مؤقت واحد ، و 28 ميكرولترا من خليط نوكلياز داخلي. امزج التفاعلات مع ماصة لطيفة.

الآن احتضان التفاعلات عند 65 درجة مئوية لمدة نصف ساعة. عند اكتمال التفاعلات ، اسحب المحلول بدوران سريع واجمع 25 ميكرولترا من التفاعلات في أنابيب جديدة. إلى هذه الحصص ، أضف 2.4 ميكرولتر من البكتيريا العقدية TTR في مخزن عند مللي مولار واحد لكل مونومر من العقدية العدين.

الآن احتضان هذا التفاعل لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أضف خمسة ميكرولترات من ستة × مخزن مؤقت للتحميل إلى التفاعلات المكتملة ونفد 10 ميكرولتر على هلام 1٪ agros عند 80 فولت لمدة ساعة تقريبا. ثم تصور النطاقات mt A هو اختصار للنقل الموجه بنقل الميثيل للمجموعات المنشطة.

في هذا العرض التوضيحي ، تم تعيين الميثيل ترانسفيراز سبعة وتسعة والعامل المساعد المنشط المزدوج C ثمانية. تستخدم اليشهير لتسمية ليسين أربعة من هيستون H ثلاثة. بعد إذابة المكونات على خليط تفاعل 20 ميكرولتر لإصلاح الجليد ، يحتوي محلول الفحص على مخزن مؤقت للتعديل 10 ميكرومولار من هيستون H ثلاثة ويضاف آخر 10 ميكرومولار من ترانسفيراز الميثيل بالإضافة إلى 600 ميكرومولار من العامل المساعد.

قم بالتحكم في الإنزيم عن طريق استبدال الماء منزوع الأيونات ب C eight ON. قم أيضا بإجراء تحكم في العامل المساعد لتصور التعديلات غير المحددة من خلال تضمين 60 ملليموريال من ADO التقى للتنافس مع العوامل المساعدة الاصطناعية. الآن امزج التفاعلات مع الأنابيب البطيئة وتحقق من درجة الحموضة باستخدام شرائط الاختبار. يتم تخزين نظائر العامل المساعد المنشط المزدوج في ظل ظروف C.

لذلك ، يمكن أن يتغير الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل عن طريق إضافة عامل مساعد إذا لزم الأمر بكميات صغيرة من 50 مللي مولار هيدروكسيد الصوديوم لضبط الأس الهيدروجيني. الآن احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين أثناء إصلاح الحضانة. جل بولي أكريلاميد 12٪ SDS قبل انتهاء الحضانة مباشرة ، اصنع 20 ميكرولترا من مزيج خمسة × نقرات يحتوي على ثلاثة مللي كبريتات النحاس المولية ، وثلاثة مللي مولار T-H-P-T-A ligand 250 ملليمولر ، وطعم ACO الصوديوم ، وستة مللي مولار تمارا أزيد.

في نهاية الحضانة ، أضف خمسة ميكرولترات من مزيج النقر إلى كل تفاعل واخلط التفاعلات ببطء عن طريق كل مداعبة. احم التفاعلات من الضوء باستخدام ورق القصدير واحتضانها عند 20 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد ساعة ، قم بإزالة الكلوروفورم الزائد عن طريق ترسيب البروتينات.

أضف 75 ميكرولترا من الميثانول و 18.7 ميكرولتر من الكلوروفورم و 50 ميكرولترا من الماء إلى كل تفاعل وقم بدوامتها لفترة وجيزة بعد كل إضافة. بعد تحضير كل أنبوب ، قم بتدويرها عند 16،000 جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المرحلة العليا من الفصل دون إزعاج طبقة الواجهة التي تحتوي على البروتينات.

أضف الآن 56.3 ميكرولتر من الميثانول ، المرحلة السفلية والدوامة. بعد ذلك ، قم بتدوير هذا لأسفل لتكسير البروتين والتخلص من السوبينات. ثم أضف 56.3 ميكرولتر من الميثانول.

مرة أخرى ، دوامة. كرر الدوران واسترجع الكريات. دع الكريات تجف في أنابيبها ، غير مغطاة ومغطاة بورق خال من النسالة.

في وقت لاحق قم بإذابة البروتينات في 20 ميكرولتر من عازلة تحميل SDS مع صبغة التحميل. اشطف جدران الأنبوب بالمخزن المؤقت لجمع الحبيبات. ثم احتضان الأنابيب عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بمجرد استدعاء الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة ، أنفقها لفترة وجيزة لسحب محتوياتها وتصور البروتينات بواسطة صفحة SDS. تشغيل عند 120 فولت لمدة 90 دقيقة تقريبا. تم تنفيذ تفاعل الابتسام باستخدام حمض الدم الميثيل ترانسفيراز M-B-S-E-C ، والذي يعدل بقايا الأدينين الثانية ضمن تسلسل A-T-C-G-A-T المزدوج الذي تقطعت به السبل وله موقع التعرف على PBR 3 2 2 البلازميد ، والذي تم تمييزه باللون الأحمر لاختبار وضع العلامات على البلازميد.

تم تحدي PB 3 2 2 مع التقييد المؤتلف ENDONUCLEASE T one ، الذي يحتوي على سبعة مواقع على PB 3 22 مميزة باللون الأخضر ، أحدها مدرج في موقع M-B-S-E-C واحد. عند حدوث الملصقات ، يجب حماية هذا الموقع من الانقسام في الجل. تم تأكيد ذلك.

ظهر جزء جديد يحتوي على 683 زوجا أساسيا يوضح وجود ملصقات في موقع M-B-S-E-C واحد. يظهر هذا فقط في ممر الفحص ، وهو الممر الثالث. تم إثبات خصوصية تفاعل الملصقات من خلال تحول الحركة الكهربائية.

عند إضافة العدين العقدي ، تم تأخير الحركة الكهربائية لجزء زوج القاعدة 683 المسمى بالبيوتين. في حين أن حركة الشظايا بدون موقع M-B-S-E-C لم يتغير ، أو وضع العلامات على خطوتين لركائز نقل الميثيل مع نظائر مزدوجة منشطة. تم استخدام العامل المساعد هيستون H ثلاثة ليسين أربعة ميثيل ترانسفيراز سبعة تسع ، وتم استخدام العامل المساعد الصغير C ثمانية ON.

تم استخدام الرحلان الكهربائي للهلام للكشف عن التألق فقط حارة الفحص. أظهر الممر الأول نطاقا فلوريا يتوافق مع هيستون H ثلاثة مما يشير إلى أن السلسلة الجانبية للعامل المساعد قد تم نقلها على وجه التحديد وتم تصنيف البروتين المعدل ب Tamara Flora.Four. تعمل صبغة ESI كعنصر تحكم في التحميل.

أظهرت جميع الممرات نفس الكمية من البروتين. يمكن أيضا تسمية ركائز ترانسفيراز الميثيل بتفاعلات البيوتين مع البيوتين المشتق من azi. بدلا من الفلور تم الفحص عن طريق النشاف الغربي مع بيروكسيداز الفجل الحار

شوهدت ملصقات عدن المترافقة الناجحة والمحددة بعد مشاهدة هذا الفيديو. يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية تسلسل الحمض النووي والبروتين ، وتحديدا باستخدام نص التقارب أو قوة الفلور أو التسميات الأخرى. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن القابلات الأخرى ونظائرها حساسة لدرجة الحرارة.

تعامل معها دائما على الثلج وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لقد قمت بتجميع تنشيط مزدوج. نظائر MET الأخرى مع مجموعة المراسلين مدمجة بالفعل في السلسلة الجانبية واستخدمتها لتسمية الحمض النووي على وجه التحديد في خطوة واحدة.

يسعدني بشكل خاص احتمال الجمع بين الإنزيمات المختلفة ومجموعات التقارير لرسم خرائط الحمض النووي باستخدام تقنيات الجزيء الفردي. الابتسام و NEC مرنان للغاية ، ويمكن نقل أي مجموعات كيميائية تقريبا ليس فقط إلى الحمض النووي والبروتينات ، ولكن أيضا إلى الحمض النووي الريبي والصغيرة باستخدام عمليات نقل الميثامفيتامين المناسبة.