دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء فحص كيميائي في أجنة أسماك الحمار الوحشي باستخدام معالجة العينات يدويا. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع أسماك الحمار الوحشي البالغة أولا في غرف التزاوج باستخدام مقسم طوال الليل ، ثم إزالة المقسم في صباح اليوم التالي لجمع الأجنة. يتم ترتيب المجموعات التالية من أجنة الزرد في 96 لوحة بئر ، ثم يتم معالجتها بدواء في مرحلة النمو المرغوبة.

ثم يسمح للأجنة بالتطور بشكل ثابت بنسبة 4٪ بارالديهايد ومقايسة لقياس تأثيرات الجزيئات الصغيرة على العملية التنموية ذات الأهمية. تظهر النتائج تغيرات تنموية مثل اكتساب أو فقدان مجالات التعبير الجيني التي يمكن أن تشير إلى تغيرات في تكوين الكبريتات أو الأنسجة الناجمة عن الجزيئات الصغيرة التي تم استجوابها. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج السريري لمجموعة متنوعة من الأمراض بسبب القدرة على تحديد المركبات العلاجية المحتملة.

بشكل عام ، قد يكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنهم بحاجة إلى اكتساب البراعة اللازمة للعمل مع الأجنة ، مثل نقلها بين ألواح متعددة الآبار دون تلف. سأعرض الإجراء أنا وإريك دوناهو ، الباحث الجامعي في المختبر لإعداد تزاوج أسماك الحمار الوحشي. استخدم غرف التزاوج مع الفواصل ، ضع ذكور أسماك الحمار الوحشي البالغة على جانب واحد من المقسم ، وأنثى أسماك الحمار الوحشي البالغة على الجانب الآخر.

لكل 96 لوحة بئر من الجزيئات الصغيرة التي سيتم اختبارها. قم بإعداد 25 خزان تزاوج واتركها طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإزالة الغرفة التي تفصل بين كل زوج من الأسماك وبعد ساعة واحدة ، استخدم مصفاة شبكية دقيقة لجمع الأجنة قبل وضعها في أطباق بتري التي تحتوي على E ثلاثة متوسطة مع ماصة نقل.

قم بإزالة الحطام من الألواح وتحت مجسم الطباعة. راقب كل مخلب من الأجنة وقم بإزالة أي بويضات غير مخصبة. صب E ثلاثة متوسطة واستبدالها ب E ثلاثة طازجة.

ثم ضع كل طبق من الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية لمدة ساعتين. افحص الأطباق مرة أخرى وتخلص من أي بيض إضافي غير مخصب. استمر في احتضان الأجنة حتى مرحلة 40٪eely.

قم بإزالة لوحة المكتبة الكيميائية من 80 درجة مئوية تحت الصفر. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطيتها والسماح لها بالذوبان في درجة حرارة الغرفة باستخدام ماصة ثماني القنوات. أضف 99 ميكرولترا من E ثلاثة إلى الأعمدة من اثنين إلى 12 من لوحة بئر 96.

ثم أضف ميكرولتر واحد من المركبات المناسبة إلى الآبار في الأعمدة من اثنين إلى 11 هنا ، والتي تم تعيينها على أنها عينات تجريبية ماصة ميكرولتر واحد من DMSO في عمود التحكم المصمم هنا ليكون العمود 12. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية لوحة التخفيف وإعادة مكتبة المواد الكيميائية إلى الفريزر. بعد ذلك ، بعد اختيار طبق بتري يحتوي على أجنة في مرحلة 40٪ epi ، استخدم ماصة نقل لوضع حوالي 10 أجنة لكل بئر بعناية في أعمدة من اثنين إلى 12 من 96.

لوحة حسنا. استخدم ماصة نقل الزجاج لإزالة E ثلاثة الزائدة من كل بئر وطردها في حاوية نفايات سائلة. لمعالجة الأجنة كيميائيا ، انقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف كيميائي من صفيحة البئر 96 إلى بئر الأجنة المعنية لإنشاء غرفة رطبة بمنشفة ورقية ووضعها في وعاء حساس للضوء.

كبير بما يكفي لاستيعاب 96 بئر صفيحة. ثم استخدم حصيرة السقف لإغلاق اللوحة. ضعه في الحاوية الحساسة للضوء واحتضنه عند 28.5 درجة مئوية للمدة الزمنية المطلوبة.

لإزالة المواد الكيميائية ، أضف 300 ميكرولتر من E ثلاثة إلى كل صف من الآبار المعالجة بالدواء. ثم اسحب الوسط قبل استخدام E ثلاثة لغسل الأجنة ثلاث مرات لإصلاح الأجنة ، ونقلها إلى أربع ألواح بئر مصنفة 24 بئر مع وضع الماصة أمام خلفية داكنة. بعد كل عملية نقل بئر لتحديد الأجنة المتبقية في الماصة ولمنع التكسير، قم بإزالة أي أجنة ميتة.

اسحب الثلاثة E بحيث تغمر الأجنة بالكاد في السائل. ثم استخدم ماصة زجاجية لإضافة قطرتين من 50 ملليغرام لكل مليلتر بروناز لكل منهما. احتضان الأجنة جيدا لمدة خمس دقائق قبل تحريك الآبار للتسبب في تفكك كوريان.

بعد استخدام E ثلاثة لغسل الأجنة مرتين ، اسحب وتخلص من الثلاثة المتبقية من E أضف 4٪ P-F-A-P-B-S إلى كل بئر واحتضان الأجنة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإجراء شاشة ذات أهمية مثل التهجين في الموقع ، أو الرغبة كما هو موضح في بروتوكول النص لتسجيل الأجنة من الشاشة الكيميائية.

انقلها إلى 12 لوحة بئر مصنفة قبل استخدام مجهر استريو لمراقبتها كما هو موضح في هذا الرسم التخطيطي. من العملي لشخص واحد إجراء فحص جيني كيميائي على ما يقرب من 600 مركب على مدار تسعة أسابيع من الجهد المخصص ، ويمكن تقليل هذا الوقت إلى ثلاثة أسابيع إذا قام به ثلاثة أشخاص. وبالتالي ، يمكن لوقت مقاعد البدلاء لشخص واحد أو عدد قليل من الأشخاص تجاوز الحاجة إلى معدات تتطلب موارد عالية مثل الأنظمة الآلية.

كما هو موضح هنا ، تعرضت أجنة أسماك الحمار الوحشي لمركبات فردية من مكتبة نشطة بيولوجيا من 50٪ من الأشخاص إلى 24 HPF ، ثم فحصها حسب الرغبة ، باستخدام مزيج من ثلاثة مجسات ريبو للكشف عن أجزاء النيفرون. على سبيل المثال ، سيتم تصنيف نظام الدرجات ، وهو مركب نتج أدى إلى تضخم كبير في النبيبات المعقدة القريبة أو معاهدة التعاون بشأن البراءات على أنه من الفئة الأولى ، والتي تمثل الفئة المرتبطة بأشد العيب وأعلى مستوى من الثقة في النمط الظاهري الذي لوحظ. وعندئذ يشرح المركب على أنه معاهدة التعاون بشأن البراءات من الفئة الأولى.

بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا التصنيف طريقة بسيطة وسريعة لوصف جزيء صغير ذي أهمية ، بما في ذلك شدة تأثيره على الكائن الحي ، والمنطقة التي تتأثر بالدواء ، والطريقة التي تتأثر بها المنطقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحديد مراحل الأجنة في النقطة الزمنية الصحيحة للنمو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص كيميائي يدوي مع أجنة الزرد.