متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

يتضمن الاندماج الكهربائي تطبيق نبضات كهربائية قصيرة عالية الجهد على الخلايا في سياق قريب. في هذا الفيديو ، نوضح الاندماج الكهربائي للخلايا في المختبر عن طريق طريقة الالتزام المعدلة. أجريت التجارب على خلايا الورم الميلانيني للفأر ، BF واحدة.

بالنسبة للتجربة، اتبع الخطوات التالية. قم بزراعة الخلايا في قارورتين منفصلتين للتقاء بنسبة 80٪. بشكل منفصل ، أضف 2.1 ميكرولتر من كل محلول مخزون.

10 مللي مولار C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي إلى ثلاثة ملليلتر من Kraebs Hess Buffer في أنبوب طرد مركزي. اشطف الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت Krebs Hess ثم أدخل محاليل التحميل في القوارير. تحتوي محاليل التحميل على ما يقرب من سبعة ميكرومولار C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي.

احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في جو خاضع للرقابة. خلال هذه الحضانة الأولى ، تمر المناطق بحرية عبر أغشية الخلايا إلى العصارة الخلوية حيث يتم تحويلها إلى منتجات تفاعل دائم IMP الغشائية. بعد هذه الحضانة الأولى ، اشطف الخلايا ثم احتضانها بوسط مزرعة لمدة ساعتين أخريين.

تتم ملاحظة الخلايا باستخدام مجهر مضان مزود بكاميرا CCD مبردة في برنامج الاستحواذ. اضبط الطول الموجي للإثارة على 548 نانومتر واختر صورة مضان مناسبة لمرشح تمرير النطاق للخلايا المحملة ب CMRA للخلايا المحملة ب C-M-F-D-A. اضبط الطول الموجي للإثارة على 492 نانومتر واختر مرشح تمرير النطاق لعيون التربسين ذات الصورة الفلورية الخضراء ، واحسب الخلايا في كلتا القوارير واخلط الخلايا الحمراء والخضراء معا بنسبة واحد إلى واحد ، اضبط تركيز الخلية إلى 5 ملايين خلية لكل مليلتر.

ضع قطرة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في منتصف كل بئر. في 24 صفيحة متعددة الآبار ، احتضن الخلايا في جو خاضع للرقابة لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق قليلا بسطح البئر في طبقة أحادية وإنشاء اتصالات خلوية فيما بينها. ضع البئر المتعدد مع الخلايا على مرحلة المجهر.

ضع الأقطاب الكهربائية في قاع البئر وقم بتوصيلها بمولد النبض لتحقيق الاندماج الكهربائي الأمثل والحفاظ على صلاحية الخلية ، يجب استخدام المعلمات المناسبة للنبضات الكهربائية. تعتمد هذه المعلمات على خط الخلية ويجب تحديدها في التجارب الأولية. قم بإزالة وسط الاستزراع واغسل الخلايا بمخزن فوسفات البوتاسيوم ISO omu عند 350 ميكرولتر من مخزن فوسفات البوتاسيوم ميلر من أجل إحداث تورم الخلايا.

اترك الخلايا في عازلة مفرطة الأنظار لمدة دقيقتين قبل تطبيق النبضات الكهربائية. يجب تطبيق النبضات الكهربائية عندما تكون الخلايا قريبة من أحجامها القصوى. هذا قبل أن يبدأوا الحجم التنظيمي.

انخفاض في تجربتنا. تم تطبيق قطار من ثماني نبضات مستطيلة بمدة 100 ميكروثانية عند هرتز واحد. بعد التسليم النبضي.

اترك الخلايا دون إزعاج لمدة 10 دقائق بعد 10 دقائق. تحديد عائد الانتشار عن طريق تباين الوجه والمجهر الفلوري. E الحصول على ثلاث صور ، تباين الوجه ، مضان أحمر وأخضر في خمسة مجالات رؤية تم اختيارها عشوائيا.

في كل منها ، قم بإنشاء ثلاث صور من كل صورة ثلاثية في برنامج Image J من أجل تحسين الجودة المرئية للصور إلى خطوات المعالجة المسبقة التي يمكن تطبيقها على الصور الأصلية والخلفية والطرح وتحسينات التباين مع مجموعات المعلمات الافتراضية. أخيرا ، يتم تكوين ثلاث صور قناة باستخدام RGB إلى الصورة الرمادية J المكون الإضافي. في مثل هذه الصورة ، يمكن رؤية السيتوبلازم أثناء الراحة مع أغشية الخلايا.

وبالتالي يمكن بسهولة تحديد عدد قليل من الخلايا في عدد الصور ثلاثي القنوات جميع الأنواع الثلاثة من الخلايا ، الأحمر والأخضر والفلورسنت المزدوج. حدد النسبة المئوية للخلايا الفلورية المزدوجة بقسمة عدد الخلايا الفلورية المزدوجة مع عدد من جميع الخلايا في كل صورة. ثم يتم تعريف عائد الاندماج على أنه النسبة المئوية للخلايا الفلورية المزدوجة مضروبة في اثنين.

نظرا لأنه لا يتم اكتشاف نصف خلايا العرض عند عرض الخلايا من نفس اللون.