Name: متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: تعلم تقنية الانصهار الكهربائي للخلايا في المختبر باستخدام طريقة الالتصاق المعدلة. يوضح هذا البروتوكول كيفية دمج خلايا الميلانوما الفأرية وتحليلها بالمجهر الضوئي الفلوري.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل وكالة أبحاث السلوفينية (J2 - 9764 مشروع وبرنامج P2 - 0249). هذا الفيديو يمثل المواد التكميلية عن &quot;تقنيات Electroporation القاعدة والعلاج&quot; ورشة عمل علمية ودورة الدراسات العليا ، الذي نظمته كلية الهندسة الكهربائية في جامعة ليوبليانا ، سلوفينيا.

أولا تحميل الخلايا مع الخلايا بتتبع CMFDA وCMRA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أجريت تجارب على خلايا سرطان الجلد معدة مسبقا من الماوس خط الخلية (B16 - F1). تزرع الخلايا في اثنين من فصل القوارير 25 سم ثقافة 2 (TPP ، ZDA) لالتقاء 70-80 ٪ في المتوسط ​​الثقافة DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ ، 0.15 ملغ / مل L - الجلوتامين ، 16 ملغ / مل جنتاميسين (جميع من سيغما الدريخ ، ألمانيا) ، 200 وحدة / مل crystacillin (شركة بليفا ، كرواتيا) ، وحضنت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد two الأسهم 10 ملم حلول تعقب الخلية (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وذلك بإضافة 10.76 ميكرولتر و 9 ميكرولتر (على الأخضر والبرتقالي CMFDA CMRA ، على التوالي) من DMSO (سيغما الدريخ ، ألمانيا) إلى 50 ميكروغرام من الصبغة في النص الأصلي Invitrogen القارورة. ويمكن تخزين محلول المخزون في ثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أشهر. قبل البدء في التجارب ، والاحماء الحل حتى تذوب بلورات DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد خالية من بيكربونات كريبس - Hepes العازلة (130 مم كلوريد الصوديوم و 4.7 ملي بوكل ، 1.2 ملي MgSO 4 ، 1.2 ملم KH 2 PO 4 ، 11.7 ملي D - غلوكوز ، 1.3 ملي CaCl 2 ، 10 HEPES ملي ، ودرجة الحموضة 7.4). في اثنين من 15 مل إيبندورف أنابيب منفصل مزيج 2.1 ميكرولتر من كل حل سهم (10 ملم أو CMFDA CMRA ، على التوالي) في 3 مل من العازلة كريبس - Hepes بيكربونات خالية. هذه الغلة "حل تحميل" التي تحتوي على ما يقرب من 7 CMFDA ميكرومتر (أو CMRA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرتين مع العازلة كريبس - Hepes بيكربونات خالية من ثم إدراج وتحميل حلول في قوارير. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الكواشف حضانة first يمر بحرية من خلال أغشية الخلايا ، ولكن مرة واحدة داخل الخلية ، وتحولت إلى خلية الكواشف impermeant منتجات التفاعل الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة الأولى ، واحتضان شطف الخلايا مع مستنبت لمدة ساعتين في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا في كل من قوارير (محملة CMFDA وCMRA) ومزيج خلايا الدم الحمراء والخضراء معا في نسبة 1:1 في أنبوب الطرد المركزي 50 مل (TPP ، ZDA). ضبط تركيز الخلية إلى الخلايا 5 × 6 / 10 مل من قبل مع تخفيف DMEM المتوسطة أو مع تركيز أجهزة الطرد المركزي. مكان انخفاضا بنسبة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من لوحة multiwell 24 (TPP ، ZDA). احتضان خلايا في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح لهم نعلق قليلا على سطح البئر وإقامة اتصالات الخلية. </li></ol> II. الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد isoosomolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 250 ملي السكروز) وhypoosmolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 75 ملي السكروز) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع multiwell مع الخلايا على موقف المجهر ، مرحلة الأقطاب في قاع البئر وربطها مولد النبض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1 مل من isoosomolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم. إضافة 350 ميكرولتر من hypoosmolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم من أجل حمل تورم الخلية. ينبغي أن تغطي العازلة الأقطاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلايا في hypoosmolar العازلة لمدة 2 دقيقة قبل تطبيق نبضات كهربائية. خلال هذا الوقت من تدفق جزيئات الماء في الخلايا نتيجة لاختلال التوازن التناضحي بين الداخل والخارج من الخلايا يسبب زيادة حجم الخلية. ينبغي أن تطبق النبضات الكهربائية عند الخلايا هي قريبة من أحجامها القصوى ، وذلك قبل بدء انخفاض حجم التنظيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الكهربائي الأمثل والحفاظ على سلامة الخلية ، يجب استخدام المعلمات الأمثل للنبضات الكهربائية. هذه تعتمد على خط الخلية المستخدمة [1]. في هذه التجربة يتم تطبيقها قطار من 8 البقول مستطيلة (مع كل مدة من 100 ميكرو ثانية في 1 هرتز) لكل عينة ، وذلك باستخدام جهاز electroporation (Cliniporator في حالتنا ، IGEA ، إيطاليا). يتم تسليم لنبضات كهربائية متوازيين سلك حزب العمال / عير بقطر 0.8 ملم و 5 ملم المسافة بينهما ، وتهيئة المجال الكهربائي لحوالي 1200 V / سم بين الأقطاب في كل بئر ، باستثناء عنصر التحكم بشكل جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلايا دون عائق لمدة 10 دقيقة بعد الولادة النبض. تحديد العائد الانصهار عن طريق الفحص المجهري النقيض الفلورسنت والمرحلة. </li></ol> III. الحصول على الصور وتحديد العائد الانصهار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلاحظ في الخلايا باستخدام المجهر مضان (في حالة لدينا زايس AxioVert 200 ، زايس ، ألمانيا) مجهزة هدفا (X20) وكاميرا CCD تبريد (VisiCam 1280 ، Visitron ، ألمانيا). يتم الحصول على الصور في MetaMorph 7.1.1 (الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ولكن يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مشابهة يمكن اكتساب. هو متحمس CMFDA مع مستوحد اللون (فازة الرابع ، Visitron والمانيا) في 492 نانومتر و 548 نانومتر في CMRA. ويتم الحصول على ومضان من CMFDA CMRA باستخدام مرشحات الانبعاثات ، أحدهما يركز على نانومتر 535 (HQ535/30m ، لCMFDA) وتركز الأخرى على 510 نانومتر (D605/55m ، لCMRA ، سواء كروما ، الولايات المتحدة). منعت استخدام مزدوج اللون المرآة (Q515LP) الحديث عبر القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ثلاث صور (المرحلة النقيض والأحمر والأخضر ومضان) لمدة خمسة حقول اختيارها عشوائيا في كل بئر. إنشاء صور ثلاثة من كل قناة الثلاثي الصورة. ويمكن في مثل هذه الصورة أن ينظر إلى السيتوبلازم الاستشعاع مع أغشية الخلايا. وبالتالي يمكن أن تنصهر فيها خلايا تحدد بسهولة [الشكل 1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد كافة الأنواع الثلاثة من الخلايا (الأحمر والأخضر والفلورسنت مزدوج) في كل صورة القناة الثلاث. تحديد نسبة الخلايا الفلورسنت مزدوج بقسمة عدد الخلايا الفلورسنت بشكل مزدوج مع عدد من كافة الخلايا في كل صورة. يتم تعريف العائد الانصهار كنسبة مئوية من الخلايا الفلورسنت مزدوج مضروبا منذ 2 لم يتم الكشف عن نصف الخلايا تنصهر (عندما خلايا فتيل نفس اللون). </li></ol> ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 ثلاثة صورة مجهرية قناة B16F1 الخلايا بعد الكهربائي : المرحلة المقابل ، CMRA مضان (الإثارة في 548 نانومتر) وCMFDA مضان (الإثارة في 492 نانومتر) ، التكبير الهدف 20X

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدرة على المزج بين أغشية الخلايا غير محدد ، على سبيل المثال ، من خلال الحقول الكهربائية الخارجية ، والمهم في الطب ، والتكنولوجيا الحيوية والبحوث في علم الأحياء. الانصهار غير محدد من هذا القبيل تتيح انتاج الخلايا الهجينة ذات قيمة عالية ومنتجاتها ، مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، ويوفر معلومات حول الآليات الأساسية [2] الانصهار. الكهربائي هو طريقة فعالة للغاية نظرا لاحتمال أنه يمكن تعديلها بشكل صحيح إلى أنواع مختلفة من الخلايا. ويتحقق الكهربائي عندما يتم إحضارها الخلايا في اتصال جسدي وثيق في دولتهم fusogenic (عرضة للانصهار) عن طريق الضغط العالي نبضات كهربائية. كفاءة الكهربائي يعتمد على مختلف المعايير التي تؤثر على جزأين من عملية الكهربائي. الجزء الأول من عملية الكهربائي هو تحقيق الاتصال الجسدي الوثيق بين الخلايا ، ويمكن الحصول عليها بطرق مختلفة [3-8]. ويمكن استخدام أسلوب الالتزام (الخلايا المتنامية لالتقاء) نظرا لكفاءة الاتصالات الخلية أنشئت عفويا في مناطق واسعة بين الخلايا ، إلا أنها تنتج خلايا كبيرة جدا تنصهر مع العديد من النوى. نحن نستخدم طريقة التقيد تعديل ، حيث يتم الحصول على الخلايا الصغيرة (مع النوى 2-5) ، والتي هي أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة وتتكاثر ، (الشكل 1). الاتصال بين الخلايا تستفيد أيضا من تورم التناضحي من الخلايا ، وذلك بسبب المعاملة التناضحي التي استخدمت في التجربة [9]. الجزء الثاني من عملية الكهربائي هو تحقيق الدولة fusogenic للأغشية الخلية. الدولة Fusogenic يرتبط بشكل جيد مع دولة electropermeabilized الغشاء (خلايا غير قابلة للتحديدا permeabilized إلى الجزيئات التي عادة لا يمكن ان تمر من خلال الغشاء سليمة) ، وتحكمها نفس المعلمات من نبضات كهربائية (السعة ، وطولها ، وعدد وتردد) [10] . قيم المعلمات الكهربائية اللازمة لelectroporation الأمثل [1] ، وتختلف الكهربائي بين الخلايا المختلفة ، وتعتمد على حجم الخلايا وخصائصها البيولوجية. معلمات الكهربائية وبالتالي الحاجة إلى أن يكون الأمثل لخطوط مختلفة من الخلايا ، والتي تستخدم كشركاء الانصهار ، للحصول على الانصهار.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>صبغة فلورية سيتوبلازمية</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>صبغة فلورية سيتوبلازمية</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>وسط ديولبيكو المعدل إيجل Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium</td></tr><tr><td>مصل العجل الجنيني</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacillin</td><td>كاشف</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>مضاد حيوي</td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>مضاد حيوي</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>كاشف</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>كاشف</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>كاشف</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>السكروز</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>جهاز توليد النبضات الكهربائية</td><td>أداة</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>صفيحة متعددة الآبار</td><td>أداة</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب طرد مركزي سعة 50 ml</td><td>أداة</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب طرد مركزي سعة 15 ml</td><td>أداة</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>دورق زراعة سعة 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>أداة</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>أقطاب كهربائية</td><td>أداة</td><td>تصنيع خاص</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

الكهربائي الخلية هو طريقة آمنة وغير الفيروسية وغير الكيميائية التي يمكن استخدامها لتحضير الخلايا الهجينة لعلاج البشر. الكهربائي ينطوي على تطبيق نبضات قصيرة عالية الجهد الكهربائي للخلايا التي هي على اتصال وثيق. تطبيق قصيرة ، والبقول الكهربائية ذات الجهد العالي يسبب زعزعة الاستقرار في أغشية الخلايا البلازمية. الأغشية زعزعة الاستقرار أكثر نفاذا لجزيئات مختلفة ، وعرضة أيضا للاندماج مع أي الأغشية المجاورة زعزعة الاستقرار. الكهربائي وبالتالي وسيلة مريحة لتحقيق الانصهار غير محددة من خلايا مختلفة جدا<em&gt; في المختبر</em&gt;. من أجل الحصول على أغشية الخلية الانصهار ، تزعزع الحقل الكهربائي ، يجب أن تكون في اتصال وثيق للسماح بدمج طبقات ثنائية الدهون ، وبالتالي السيتوبلازم بهم. في هذا الفيديو ، ونظهر الكهربائي كفاءة الخلايا<em&gt; في المختبر</em&gt; عن طريق تعديل طريقة الانضمام. في هذا الأسلوب ، ويسمح للخلايا لنعلق قليلا فقط على سطح البئر ، بحيث يمكن أن يتم تبادل والمتوسطة والحفاظ على الخلايا لا يزال شكلها الكروي. ويتم تقييم التصور الانصهار بواسطة وضع العلامات السابقة للسيتوبلازم الخلايا مع مختلف الأصباغ الفلورية تعقب الخلية ؛ وصفت من نصف الخلايا مع CMRA البرتقال والنصف الآخر مع CMFDA الخضراء. يتم تحديد العائد الانصهار حيث بلغ عدد خلايا تنقسم الفلورسنت مزدوج مع عدد من الخلايا كل ضرب من قبل اثنين.

في هذا الفيديو نظهر الكهربائي كفاءة الخلايا<em&gt; في المختبر</em&gt; من خلال طريقة الانضمام تعديلها باستخدام electroporation والكشف اللاحق للخلايا التصور تنصهر مع المجهري مضان.

يعد الاندماج الكهربائي للخلايا طريقة آمنة وغير فيروسية وغير كيميائية يمكن استخدامها لتحضير الخلايا الهجينة للعلاج البشري. يتضمن الاندماج الكهربائي...

يتضمن الاندماج الكهربائي تطبيق نبضات كهربائية قصيرة عالية الجهد على الخلايا الموجودة في سياق متقارب. في هذا الفيديو، نستعرض الاندماج الكهربائي للخلايا في المختبر (in vitro) عن طريق طريقة الالتصاق المعدلة. أجريت التجارب على خلايا ميلانوما الفأر، BF one.لإجراء التجربة، اتبع الخطوات التالية. قم بنمو الخلايا في قارورتي مزرعة منفصلتين حتى تصل درجة التلاحم إلى 80%. وبشكل منفصل، أضف 2.1 µL من كل محلول مخزون.أضف 10 millimolar من C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي إلى ثلاثة milliliters من Krebs Hess Buffer في أنبوب طرد مركزي. اغسل الخلايا مرتين باستخدام Krebs Hess buffer، ثم أدخل محاليل التحميل في القوارير. تحتوي محاليل التحميل على حوالي سبعة Micromolar من C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي.قم بتحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة في جو متحكم به. وخلال فترة التحضين الأولى هذه، تعبر المناطق بحرية عبر أغشية الخلايا إلى العصارة الخلوية حيث تتحول إلى نواتج تفاعل نفاذة لغشاء IMP. وبعد انتهاء فترة التحضين الأولى، اشطف الخلايا ثم قم بتحضينها في وسط استزراع لمدة ساعتين إضافيتين.يتم فحص الخلايا باستخدام مجهر فلوري مجهز بكاميرا CCD مبردة في برنامج الاستحواذ. اضبط طول موجة الإثارة على 548 نانومتر واختر مرشح تمرير نطاق مناسب لصورة الفلورة للخلايا المحملة بـ CMRA، وبالنسبة للخلايا المحملة بـ C-M-F-D-A، اضبط طول موجة الإثارة على 492 نانومتر واختر مرشح تمرير نطاق لصورة الفلورة الخضراء، ثم قم بعد الخلايا في كلتا القارورتين واخلط الخلايا الحمراء والخضراء معاً بنسبة واحد إلى واحد، واضبط تركيز الخلايا ليصبح 5 مليون خلية لكل ملليلتر.ضع قطرة بحجم 20 µL من معلق الخلايا في منتصف كل بئر. وفي طبق متعدد الآبار سعة 24 بئراً، قم بتحضين الخلايا في جو محكوم لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق قليلاً بسطح البئر في طبقة أحادية وتكوين اتصالات خلوية فيما بينها. ضع الطبق متعدد الآبار الذي يحتوي على الخلايا على منصة المجهر.ضع الأقطاب الكهربائية في قاع البئر وقم بتوصيلها بمولد النبضات. ولتحقيق دمج كهربائي مثالي والحفاظ على حيوية الخلايا، يجب استخدام معاملات مناسبة للنبضات الكهربائية. تعتمد هذه المعاملات على الخط الخلوي ويجب تحديدها في تجارب أولية. قم بإزالة وسط الزرع واغسل الخلايا بـ 1 mL من محلول potassium phosphate buffer بتركيز ISO omu، ثم بـ 350 µL من محلول hypos Miller potassium phosphate buffer لتحفيز تورم الخلايا.اترك الخلايا في محلول منظم عالي الأسموزية لمدة دقيقتين قبل تطبيق النبضات الكهربائية. يجب تطبيق النبضات الكهربائية عندما تكون الخلايا قريبة من أحجامها القصوى، أي قبل أن تبدأ في عملية تنظيم الحجم.انخفاض في تجربتنا. تم تطبيق سلسلة من ثماني نبضات مستطيلة بمدة 100 microseconds وبتردد واحد hertz. بعد إيصال النبضات.اترك الخلايا دون تحريك لمدة 10 دقائق بعد مرور 10 دقائق. حدد عائد الانتشار بواسطة مجهر تباين الطور والمجهر الفلوري. التقط ثلاث صور، تباين الطور، والفلورة الحمراء والخضراء في خمسة حقول رؤية مختارة عشوائياً.في كل حالة، يتم إنشاء صور ثلاثية القنوات من كل مجموعة ثلاثية من الصور باستخدام برنامج Image J، وذلك لتحسين الجودة المرئية للصور بحيث يمكن تطبيق خطوات المعالجة المسبقة على الصور الأصلية، والتي تشمل طرح الخلفية وتعزيز التباين باستخدام مجموعات المعلمات الافتراضية. وأخيرًا، يتم تكوين الصور ثلاثية القنوات باستخدام ملحق RGB to gray في برنامج Image J. وفي مثل هذه الصور، يمكن رؤية السيتوبلازم في حالة الراحة جنبًا إلى جنب مع أغشية الخلايا.وبذلك، يمكن بسهولة تحديد عدد الخلايا القليلة في صورة القنوات الثلاث، حيث يتم حساب الأنواع الثلاثة من الخلايا: الحمراء، والخضراء، والمزدوجة الفلورة. يتم تحديد النسبة المئوية للخلايا مزدوجة الفلورة عن طريق قسمة عدد الخلايا مزدوجة الفلورة على إجمالي عدد الخلايا في كل صورة. ثم تُعرَّف حصيلة الاندماج بأنها النسبة المئوية للخلايا مزدوجة الفلورة مضروبة في اثنين.نظرًا لعدم اكتشاف نصف خلايا الرؤية عند فحص خلايا ذات ألوان رؤية متماثلة.

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

صفنا السمات الهيكلية للنقاط الاشتباك العصبي الدبق العصبي العضلي في نسيج الرواية إعداد الداخل التدريجي من استخدام يرقات الذباب يعيش الأصباغ الفلورية مع المجهري متحد البؤر. نحن المسمى محطات عصبون تعيش مع الأجسام المضادة الأولية الفلورسنت لHRP ، وكذلك تصور الفضاء perisynaptic مع Dextrans الفلورسنت.

تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون

نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

وقد تم تكييف هذه التقنية لتحليل مورفولوجيا CLEM التركيبية للأغشية، العضيات، والهياكل المتضررة من الجزيئات التحت خلوية microinjected. هذا الأسلوب يجمع بين تقنيات قوية من المجهرية / حقن مكروي، المجهري متحد البؤر الفلورسنت، والمجهر الإلكتروني للسماح للقرار نانومتر ملليمتر متعددة. هذه التقنية هي قابلة للطائفة واسعة من التطبيقات.

ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية

المصدر: أيغرين، إل. وآخرون. الاستيعاب والمراقبة للجزيئات الحيوية الفلورية في الكائنات الدقيقة الحية عبر الحفر الكهربائي.  J. Vis. Exp. (2015)يوضح الفيديو كيفية توصيل الجزيئات الحيوية الفلورية إلى خلايا ميكروبية كهروفية باستخدام الحفر الكهربائي. تبدأ العملية بإدخال حمض نووي أو بروتينات موسومة بالفلوروفور إلى نظام تعليق الخلايا المبرد. ثم يتم تطبيق نبضة عالية الجهد لإنشاء مسام غشائية مؤقتة، مما يمكن دخول الجزيئات الحيوية إلى السيتوبلازم. بعد الاستعادة، تخضع الخلايا للغسل والترشيح لإزالة الجزيئات...

توصيل الجزيئات الحيوية الفلورية المعتمدة على الحفر الكهربائي إلى الخلايا البكتيرية

نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلوية.

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

ويستخدم رباعي الأبعاد (4D) التصوير لدراسة السلوك والتفاعلات بين نوعين من الإندوسومات في العيش المحطات العصبية الفقاريات. وتتميز حركة هذه الهياكل الصغيرة في ثلاثة أبعاد، والسماح تأكيد الأحداث مثل الانصهار جسيم داخلي وإيماس.

تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

دراسات الجزيئات الحيوية في الجسم الحي ضرورية لفهم الوظيفة الجزيئية في السياق البيولوجي. نصف هنا طريقة جديدة تسمح باستيعاب الجزيئات الحيوية الفلورية ، مثل الحمض النووي أو البروتينات ، في الكائنات الحية الدقيقة الحية. كما يتم تقديم ومناقشة تحليل البيانات في الجسم الحي المسجلة بواسطة الفحص المجهري الفلوري.

استيعاب ومراقبة من نيون جزيئات حيوية في الكائنات الدقيقة الحية عبر Electroporation لل

يستخدم هذا البروتوكول التثقيب الكهربائي لإدخال البروتينات المسماة بالفلورسنت والتعبير عنها في ألياف عضلات الفأر. بعد التعافي بعد التثقيب الكهربائي ، يتم عزل الألياف. ثم يتم تصوير الألياف الفردية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة لتصور بنية العضلات.

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

ويصف هذا البروتوكول أسلوب جديد يسمح للتصور الكمي من تشكيل معقدة من البروتينات الفخ، استناداً إلى نقل الطاقة الرنين فورستر، وعمر fluorescence التصوير المجهري.

تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

الغرض من هذا البروتوكول هو دمج نوعين مختلفين من الخلايا لإنشاء خلايا مختلطة. يستخدم تحليل المجهر الفلوري للخلايا المنصهرة لتتبع الخلية الاصليه للعضيات الخلوية. يمكن استخدام هذا الفحص لاستكشاف كيفيه استجابه البنية الخلوية والوظيفة للاضطراب بواسطة دمج الخلايا.

خلايا خليه الانصهار من الجينوم تحرير خطوط الخلايا لاضطراب الهيكل الخلوي والوظيفة

يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير متحدة البؤرة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية. تشمل أوضاع الاندماج هذه 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والتشغيل) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الانصهار ، 2) الاندماج ، الذي ينطوي على فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار الانكماشي ، الذي ينطوي على انكماش الحويصلة المنصهرة.

المجهر البؤري لقياس ثلاثة أنماط من ديناميكيات مسام الانصهار في خلايا الكرومافين الكظرية

تعلم تقنية الانصهار الكهربائي للخلايا في المختبر باستخدام طريقة الالتصاق المعدلة. يوضح هذا البروتوكول كيفية دمج خلايا الميلانوما الفأرية وتحليلها بالمجهر الضوئي الفلوري.

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

استكشف المزيد من الفيديوهات