متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري
يوليو 1, 2010
في هذا الفيديو نظهر الكهربائي كفاءة الخلايا في المختبر من خلال طريقة الانضمام تعديلها باستخدام electroporation والكشف اللاحق للخلايا التصور تنصهر مع المجهري مضان.
يتضمن الاندماج الكهربائي تطبيق نبضات كهربائية قصيرة عالية الجهد على الخلايا في سياق قريب. في هذا الفيديو ، نوضح الاندماج الكهربائي للخلايا في المختبر عن طريق طريقة الالتزام المعدلة. أجريت التجارب على خلايا الورم الميلانيني للفأر ، BF واحدة.
بالنسبة للتجربة، اتبع الخطوات التالية. قم بزراعة الخلايا في قارورتين منفصلتين للتقاء بنسبة 80٪. بشكل منفصل ، أضف 2.1 ميكرولتر من كل محلول مخزون.
10 مللي مولار C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي إلى ثلاثة ملليلتر من Kraebs Hess Buffer في أنبوب طرد مركزي. اشطف الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت Krebs Hess ثم أدخل محاليل التحميل في القوارير. تحتوي محاليل التحميل على ما يقرب من سبعة ميكرومولار C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي.
احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في جو خاضع للرقابة. خلال هذه الحضانة الأولى ، تمر المناطق بحرية عبر أغشية الخلايا إلى العصارة الخلوية حيث يتم تحويلها إلى منتجات تفاعل دائم IMP الغشائية. بعد هذه الحضانة الأولى ، اشطف الخلايا ثم احتضانها بوسط مزرعة لمدة ساعتين أخريين.
تتم ملاحظة الخلايا باستخدام مجهر مضان مزود بكاميرا CCD مبردة في برنامج الاستحواذ. اضبط الطول الموجي للإثارة على 548 نانومتر واختر صورة مضان مناسبة لمرشح تمرير النطاق للخلايا المحملة ب CMRA للخلايا المحملة ب C-M-F-D-A. اضبط الطول الموجي للإثارة على 492 نانومتر واختر مرشح تمرير النطاق لعيون التربسين ذات الصورة الفلورية الخضراء ، واحسب الخلايا في كلتا القوارير واخلط الخلايا الحمراء والخضراء معا بنسبة واحد إلى واحد ، اضبط تركيز الخلية إلى 5 ملايين خلية لكل مليلتر.
ضع قطرة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في منتصف كل بئر. في 24 صفيحة متعددة الآبار ، احتضن الخلايا في جو خاضع للرقابة لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق قليلا بسطح البئر في طبقة أحادية وإنشاء اتصالات خلوية فيما بينها. ضع البئر المتعدد مع الخلايا على مرحلة المجهر.
ضع الأقطاب الكهربائية في قاع البئر وقم بتوصيلها بمولد النبض لتحقيق الاندماج الكهربائي الأمثل والحفاظ على صلاحية الخلية ، يجب استخدام المعلمات المناسبة للنبضات الكهربائية. تعتمد هذه المعلمات على خط الخلية ويجب تحديدها في التجارب الأولية. قم بإزالة وسط الاستزراع واغسل الخلايا بمخزن فوسفات البوتاسيوم ISO omu عند 350 ميكرولتر من مخزن فوسفات البوتاسيوم ميلر من أجل إحداث تورم الخلايا.
اترك الخلايا في عازلة مفرطة الأنظار لمدة دقيقتين قبل تطبيق النبضات الكهربائية. يجب تطبيق النبضات الكهربائية عندما تكون الخلايا قريبة من أحجامها القصوى. هذا قبل أن يبدأوا الحجم التنظيمي.
انخفاض في تجربتنا. تم تطبيق قطار من ثماني نبضات مستطيلة بمدة 100 ميكروثانية عند هرتز واحد. بعد التسليم النبضي.
اترك الخلايا دون إزعاج لمدة 10 دقائق بعد 10 دقائق. تحديد عائد الانتشار عن طريق تباين الوجه والمجهر الفلوري. E الحصول على ثلاث صور ، تباين الوجه ، مضان أحمر وأخضر في خمسة مجالات رؤية تم اختيارها عشوائيا.
في كل منها ، قم بإنشاء ثلاث صور من كل صورة ثلاثية في برنامج Image J من أجل تحسين الجودة المرئية للصور إلى خطوات المعالجة المسبقة التي يمكن تطبيقها على الصور الأصلية والخلفية والطرح وتحسينات التباين مع مجموعات المعلمات الافتراضية. أخيرا ، يتم تكوين ثلاث صور قناة باستخدام RGB إلى الصورة الرمادية J المكون الإضافي. في مثل هذه الصورة ، يمكن رؤية السيتوبلازم أثناء الراحة مع أغشية الخلايا.
وبالتالي يمكن بسهولة تحديد عدد قليل من الخلايا في عدد الصور ثلاثي القنوات جميع الأنواع الثلاثة من الخلايا ، الأحمر والأخضر والفلورسنت المزدوج. حدد النسبة المئوية للخلايا الفلورية المزدوجة بقسمة عدد الخلايا الفلورية المزدوجة مع عدد من جميع الخلايا في كل صورة. ثم يتم تعريف عائد الاندماج على أنه النسبة المئوية للخلايا الفلورية المزدوجة مضروبة في اثنين.
نظرا لأنه لا يتم اكتشاف نصف خلايا العرض عند عرض الخلايا من نفس اللون.
النظرة العامة
يوضح هذا الفيديو عملية الانصهار الكهربائي الفعّال للخلايا في المختبر باستخدام طريقة الالتصاق المعدلة جنبًا إلى جنب مع التوصيل الكهربائي. يشمل العملية كشف الخلايا المنصهرة من خلال المجهر الفلوري.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تقنيات انصهار الخلايا
- طرق التوصيل الكهربائي
- تطبيقات المجهر الفلوري
الخلفية
- الانصهار الكهربائي هو تقنية تطبق نبضات كهربائية لتسهيل انصهار الخلايا.
- يمكن أن تزيد هذه الطريقة من كفاءة إنشاء الخلايا الهجينة.
- يتيح المجهر الفلوري تصور الخلايا المنصهرة.
- فهم انصهار الخلايا أمر بالغ الأهمية للعديد من التطبيقات البيولوجية.
هدف الدراسة
- لإظهار طريقة موثوقة لـ الانصهار الكهربائي للخلايا.
- لتصور وتحديد كفاءة انصهار الخلايا.
- لتوفير بروتوكول يمكن تكراره في المختبرات الأخرى.
الطرق المستخدمة
- تمت زراعة خلايا الأورام الميلانينية في الفئران وتحضيرها للانصهار.
- تم استخدام الأصباغ الفلورية لتسمية الخلايا قبل الانصهار.
- تم تطبيق نبضات كهربائية لحث انصهار الخلايا.
- تم استخدام المجهر الفلوري لتحليل نتائج الانصهار.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق انصهار ناجح للخلايا كما هو موضح بالفلورية.
- تم حساب النسبة المئوية للخلايا المزدوجة الفلورية لتحديد عائد الانصهار.
- تم تحديد معاملات النبضات الكهربائية المثلى لبقاء الخلايا.
- تم تحسين الجودة البصرية للصور من خلال تقنيات معالجة الصور.
الاستنتاجات
- طريقة الالتصاق المعدلة فعالة في الانصهار الكهربائي للخلايا.
- يعد المجهر الفلوري أداة قيّمة لتقييم كفاءة الانصهار.
- يمكن تكييف هذا البروتوكول لأنواع مختلفة من الخلايا في البحوث.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
