التحضير والتصوير، والكمي لالسطحية الجرثومي على الحركة فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وقياس حركة سطح البكتيريا التي تسمى الاحتشاد بطريقة قياسية وقابلة للتكرار. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير ومعالجة ألواح حركة السطح أولا. الخطوة الثانية هي تلقيح لوحات فحص الحركة السطحية بالبكتيريا واحتضان هذه الألواح في بيئة خاضعة للرقابة.

بعد ذلك ، يتم تصوير أنماط نمو البكتيريا على فحوصات اللوحة في الوقت الفعلي. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي معالجة الصور للقياس الكمي. في النهاية ، يوفر هذا الإجراء بروتوكولا موحدا لإعداد مقايسة لوحة الحركة السطحية لتوليد معلومات ديناميكية كمية مثل معدل تمدد السرب أو توزيع كثافة المنتج الحيوي للبكتيريا المشروطة السطحية.

تقوم العديد من المجموعات بإجراء فحوصات الحركة السطحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نقدم بروتوكولا منهجيا يقلل من المتغيرات المتعددة التي يمكن أن تؤدي إلى عدم الاتساق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال حركة سطح البكتيريا ، مثل كيفية استعمار البكتيريا لأنواع مختلفة من الأسطح.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لحركة احتشاد الكاذب مع بعض التعديلات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا لدراسة البكتيريا المشروطة السطحية الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التغييرات الصغيرة في البروتوكول أو بيئة المختبر يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج فحص السرب. سيوضح الإجراء مورغان ، طالب دراسات عليا من مختبري.

لبدء البروتوكول ، قم بإعداد مزيج زراعي عن طريق الجمع بين 200 مل من FAB مطروحا منه وسط سرب كبريتات الأمونيوم ، و 0.9 جرام من أجار نبيل ، و 0.2 جرام من أحماض الكاينو في زجاجة وسائط سعة 500 مل. استخدم طبق التحريك لخلط الوسائط جيدا. بعد ذلك ، قم بتعقيم الوسائط في الأوتوكلاف عند 121.1 درجة مئوية لمدة 22 دقيقة مع خيار تنفيس سريع.

مباشرة بعد التعقيم ، شد غطاء زجاجة الوسائط لمنع تبخر الماء. ضع الوسائط على لوح تقليب مغناطيسي وقم بتبريد درهم إماراتي إلى 50 درجة مئوية في بيئة درجة حرارة محيطة مع التحريك النشط. إذا كان من المقرر استخدام الأجار في وقت تجريبي لاحق ، فيمكن الاحتفاظ به دافئا في حمام مائي 60 درجة مئوية أو حاضنة لمدة 15 ساعة دون تحريك نشط.

عندما تصل درجة حرارة الوسائط إلى حوالي 50 درجة مئوية عند ملليلترين من الجلوكوز المعقم بالفلتر ، باستخدام تقنيات معقمة قياسية ، امزج جيدا مع قضيب التحريك المغناطيسي لمنع تكوين الفقاعات في الوسائط. في الغطاء ، استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل 7.5 مل من الإديا في أطباق بتري فردية مقاس 60 ملم. إذا كانت هناك حاجة إلى مساحة سطح احتشاد أكبر ، فقم بتقطيع 25 لترا من الإديا في أطباق بتري مقاس 100 ملم.

اترك جميع الأطباق غير مكدسة وافحص الغطاء بمستوى نقطة الهدف لضمان سطح أفقي متساو حتى يتجمد عليه الأجار. بالنسبة للألواح التي يبلغ طولها 60 ملم ، ضع أغطية الأطباق جانبا وقم بمعالجة الأجار المكشوف في الغطاء لمدة 30 دقيقة. تتطلب الأطباق الأكبر حجما 100 ملم وقت معالجة أطول.

قد تتطلب الرطوبة وتدفق الهواء ودرجة الحرارة في مختبر معين اختبار وقت المعالجة من أجل الاحتشاد الأمثل للبكتيريا. بعد التجفيف ، يجب تلقيح APLs على الفور بالخلايا التي نمت مسبقا بشكل منفصل إلى مرحلة النمو المطلوبة. للبدء ، اختر مستعمرة بكتيريا معزولة من صفيحة LB جديدة وقم بتلقيحها في ستة ملليلتر من المزرعة. وسائط.

احتضان المزرعة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز الأفقي. في اليوم التالي ، قم بتلقيح واحد إلى خمسة ميكرولتر من المزرعة الليلية فوق ألواح أجار السرب المجففة عن طريق وخز سطح الأجار باستخدام عود أسنان معقم أو إبرة تلقيح سلكية ، اعتمادا على سلالة البكتيريا ، انقل ألواح فحص السرب إلى حاضنة مع ضبط درجة الحرارة إما على 30 درجة مئوية ، 37 درجة مئوية ، أو 42 درجة مئوية. اقلب الألواح بحيث تتكثف الرطوبة الزائدة على غطاء اللوحة وليس على الأجار ، وقم بموازنة البكتيريا عند درجات حرارة محددة للسلالة لمدة ساعتين أو أربع ساعات قبل التصوير بفاصل زمني.

بعد ذلك ، انقل الألواح إلى وحدة التصوير في الجسم الحي بحيث تكون البكتيريا الموجودة على السطح الزراعي متجهة لأسفل نحو الكاميرا المقلوبة للوحدة. املأ جميع أغطية أطباق بتري بكمية صغيرة من الماء. ثم ضع كل غطاء بحيث يكون جانب الماء متجها لأعلى فوق ألواح AER المقلوبة.

داخل وحدة التصوير، أغلق حاوية التصوير للحفاظ على مستوى رطوبة ثابت، واضبط إعدادات التصوير لوحدة التصوير وابدأ التصوير بفاصل زمني لنشاط الاحتشاد. بعد التصوير في الوقت الفعلي ، يمكن تحليل ديناميكيات احتشاد البكتيريا باستخدام تحليل الصور القياسي مثل الصورة J في تجربة حركة السطح. يعد فحص محتوى رطوبة الأجار قبل التلقيح أمرا بالغ الأهمية لتحقيق نتائج احتشاد ناجحة.

على النحو الأمثل ، ستسهل ألواح AER بقعة تلقيح ضيقة وتعزز نشاط الاحتشاد البكتيري ، في حين أن الألواح المجففة ستثبط حركة السطح بالإضافة إلى محتوى الرطوبة ، ويمكن أن يؤثر وجود أو عدم وجود إضافات وسائط أيضا على نشاط احتشاد البكتيريا كدالة لدرجة حرارة الحضانة من خلال استخدام سلالات البكتيريا ، والتعبير عن اللمعان أو البروتينات الفلورية. يمكن التقاط ديناميكيات المنافسة بين نوعين مختلفين من البكتيريا في فيديو بفاصل زمني. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا التأكد من التغيرات في كثافة الخلايا المحلية ومعدل التخليق الحيوي للدهون المعززة للحركة داخل سرب البكتيريا وتحديدها كميا باستخدام الفحص المجهري الفلوري المنقضي زمنيا.

باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل الفحص المجهري متحد البؤر من أجل الإجابة على أسئلة حول سلوك الخلية الفردية لتوليد تحليل مفصل ومجهري ومجهري لحركة سطح البكتيريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار سرب قياسي وقابل للتكرار والحصول على تحليل شامل لحركة سطح البكتيريا عن طريق تحضير فحوصات حركة السطح ومعالجتها وتلقيحها ومعالجة وتحليل النتيجة في أنماط نمو البكتيريا.