شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار هجرة الخلايا الليمفاوية التائية المستجيبة غير الملتصقة فوق طبقة أحادية من الخلايا السرطانية الملتصقة. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء طبقة أحادية من الخلايا السرطانية الملتصقة أولا في آبار شرائح التفلون المقنعة المطلية ب poly D lysine كمستجيب ثان مصنف بالفلورسنت ، يتم ترسيب الخلايا الليمفاوية التائية في مركز الطبقة الأحادية باستخدام مشعب ترسيب الخلية. بعد ذلك ، يتم استخدام الفحص المجهري للضوء والفلورة لتصور هجرة الخلايا غير الملتصقة فوق الطبقة الأحادية.

تظهر النتائج أن وظائف الهجرة والمستجيب للخلايا الليمفاوية التائية غير الملتصقة في الزراعة المشتركة مع طبقة أحادية للخلايا السرطانية الملتصقة يتم الحفاظ عليها بعد نقل الخلايا الليمفاوية بناقل فيروسي قهقري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكن قياس الهجرة الشعاعية للخلايا الليمفاوية التائية المستجيبة غير الملتصقة في ثقافة الفحم مع الخلايا السرطانية الملتصقة. هذا له آثار بعيدة المدى على المرضى الذين يعانون من أورام دماغية أولية أو نقيلية لأن الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا الخيفية التي يتم تعديلها للتعبير عن جين منشط مؤيد للأدوية ، مثل السيتوزين ديميناز ، يتم اختبارها كنهج متعدد الوسائط للقضاء على الورم في الدماغ.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة في إنشاء طبقات أحادية للخلايا السرطانية الملتصقة بسبب عدم تجانس نمو الخلايا السرطانية في خصائص الالتصاق. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات توليد طبقة أحادية متساوية للورم والترسيب الفعال ل L-O-C-T-L غير الملتصقة تتطلب فهما متمرسا لخصائص كلا النوعين من الخلايا. للبدء ، وضع ما يصل إلى أربعة معقمة.

10 شرائح مطلية بالتفلون في طبق بتري معقم 150 ملم × 15 ملم. ضع طبق بتري مقاس 35 ملم × 10 ملم يحتوي على ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من الماء المعقم بجوار الشرائح لتوفير الرطوبة. بعد ذلك ، قم بتغطية كل بئر بمحلول 100 ميكروغرام لكل مليلتر من بولي دي ليسين أو بولي إل ليسين.

احتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشق المحلول واشطف سطح البئر مرتين باستخدام PBS مع تحضير آبار العينة. احصد قارورة ملتصقة من الخلايا السرطانية الملتصقة. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق الفحص المجهري الضوئي ، ثم قم بتعليق الخلايا بتركيز خمسة في 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر.

في وسط النمو المخزن ، أضف خمسة إلى 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر ، اعتمادا على نوع الخلية السرطانية ، ورفع حجم البئر إلى 40 ميكرولترا مع الوسط والماصة لأعلى ولأسفل ببطء لتوزيع الخلايا بالتساوي. بعد بذر الآبار ، اترك الخلايا السرطانية تستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم ضع الغطاء على طبق بتري وانقله بحذر إلى حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع احتضان ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة على الأقل.

قم بتغيير وسط الاستزراع على الآبار يوميا عن طريق إزالة بعض الوسط بعناية من الطبقة الأحادية واستبداله بحجم أكبر من وسط الخلايا التائية الطازجة الكاملة. عادة ما تتلاقى الخلايا في غضون يوم إلى ثلاثة أيام لإعداد الخلايا للترسيب على طبقة أحادية الخلية السرطانية. احصد الخلايا التائية غير الملتصقة وقم بتسميتها بصبغة تكاثر الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة قبل ساعة واحدة على الأقل من الفحص.

بعد ذلك ، ضع الغرفة المرطبة التي تحتوي على شرائح الخلايا السرطانية في خزانة السلامة البيولوجية. اغسل الآبار باستخدام PBS عن طريق سحب العينات ثم أضف 45 ميكرولترا من الوسط الكامل مع مصل 10٪ إلى الآبار. حرك مشعب ترسيب خلوي معقم فوق الآبار حتى يلامس الخطاف الموجود في نهاية المشعب الجزء السفلي من الشريحة.

تأكد من أن الوسيط مرئي في القنوات المتشعبة. ثم عد الخلايا غير الملتصقة وعلقها في حالة إلى اثنتين من 10 إلى الخامس. الخلايا لكل ميكرولتر في الوسط.

بتعطيل الخلايا برفق للقضاء على أي مجموعات خلايا من شأنها أن تتداخل مع ترسيب الخلايا. قم ببسط ميكرولتر واحد من تعليق الخلية في قناة المشعب لكل منها. حسنا ، قم باحتضان الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة للسماح للخلايا الموجودة في القناة بالاستقرار على الطبقة الأحادية.

بعد أن تستقر الخلايا ، ارفع المشعب برفق لأعلى دون لمس الشريحة. تأكد من أن كريات الخلية قد تم وضعها داخل محيط القناة المتشعبة. باستخدام المجهر ، يجب أن تلتصق الخلايا الجالسة قليلا بالطبقة الأحادية بحيث لا يؤدي تحريك الشريحة برفق إلى تشتيت الحبيبات.

بعد التأكد من ترسيب الخلايا ، انقل الشريحة إلى مجهر مقلوب مجهز بغرفة ثاني أكسيد الكربون والرطوبة. استخدم هدف أربعة x للتصوير الفلوري متعدد القنوات للخلايا. احصل على صور لمنطقة معينة في قنوات المجال الساطع والفلورسنت ، ثم أضف أشرطة ميكرون باستخدام برنامج التقاط الصور.

قم بتخزين الشريحة في حاضنة مرطبة بين النقاط الزمنية بمجرد الحصول على جميع النقاط الزمنية. قم بسحب ملفات الصور وإفلاتها في برنامج تحرير الصور وحدد خيار إضافة طبقة لإنشاء ملف صورة بطبقات متعددة. ادمج الضوء والصور الفلورية في طبقة واحدة.

استخدم برنامج الاستحواذ لالتقاط صور لمساحة ثمانية ملليمترات في ثمانية ملليمترات. يجب ضبط البرنامج لتجميع الصور الملتقطة معا تلقائيا باستخدام القناة التي يتم تمثيلها بشكل أفضل عبر البئر بأكمله. إذا تم تصوير قنوات التألق فقط ، فيجب أن تكون هذه هي القناة لتصوير الخلايا الملتصقة.

بدلا من ذلك ، يمكن خياطة الصور باستخدام برنامج تحرير الصور. يتم ذلك عن طريق محاذاة مناطق الصور المحفوظة من صورة إلى أخرى وتراكب الصور فوق بعضها البعض حتى يتم إنشاء صورة كاملة. قم بتجميع الصور معا باستخدام برنامج الصور.

استخدم الصور المجمعة لإنشاء خرائط مضان شدة السطح باستخدام برنامج Image J لتصور تراكم الخلايا التائية الفلورية أو انتشارها بمرور الوقت. تتفاعل الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا البشرية والمعروفة باسم Allo CTL المنقولة ، مع ناقل فيروسي قهقري مختص يشفر جين تعبير بروتين فلورسنت أخضر الزمردي تم وضعه في وسط طبقة أحادية من خلايا الورم الدبقي. بعد أربع ساعات ، شكلت OCTL بالكامل مجاميع مرئية بحلول 24 ساعة.

ظهرت بقع فارغة في الطبقة الأحادية للخلية الملتصقة مما يشير إلى تحلل الخلايا السرطانية وهاجرت بعض allo CTL إلى ما وراء الحافة الأمامية. كانت الفئران ذات العلامات الفلورية Allo CTL جالسة في وسط طبقة أحادية من خلايا الورم الدبقي المسمى بالفلورسنت الإنفلونزا في ساعة واحدة Allo CTL مرتبطة ارتباطا وثيقا بخلايا الورم الدبقي بحلول 48 ساعة ، هاجر Allo CTL بعيدا عن مركز كثافة سطح الطبقة الأحادية. تم إنشاء خرائط مضان من هذه الصور باستخدام برنامج الصورة J وتظهر هجرة كبيرة بعيدا عن المركز بعد 48 ساعة.

من المهم تغيير وسط الثقافة يوميا لطبقة أحادية الخلية السرطانية للحفاظ على ظروف ثقافة صحية. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد إتقان ترسيب الخلايا غير الملتصقة يجب أن يستغرق حوالي 20 دقيقة بعد هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل تتبع مسار الخلية للإجابة على أسئلة حول معدل هجرة allo CTL عبر الطبقة الأحادية أو الوقت الذي تتلامس فيه مع الخلايا السرطانية التي تؤدي وظائفها السامة للخلايا.

سيساعد هذا البروتوكول الباحثين في مجال العلاج الجيني المناعي على استكشاف هجرة الخلايا الليمفاوية التائية المعدلة جينيا في الزراعة المشتركة مع الخلايا السرطانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا غير الملتصقة والملتصقة لكل ثقافة مشتركة وكيفية استخدام مشعب ترسيب الخلية لدراسة الهجرة الشعاعية الأفقية للخلايا غير الملتصقة فوق طبقة أحادية للخلية السرطانية.