شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار هجرة الخلايا اللمفاوية التائية المؤثرة غير الملتصقة فوق طبقة أحادية من الخلايا الورمية الملتصقة. ويتحقق ذلك من خلال إنشاء طبقة أحادية من الخلايا الورمية الملتصقة أولاً في آبار شرائح تيفلون المقنعة والمطلية بـ poly D lysine، وكخطوة ثانية يتم ترسيب الخلايا اللمفاوية التائية المؤثرة الموّسمة فلورياً في مركز الطبقة الأحادية باستخدام مجمع ترسيب الخلايا. بعد ذلك، يُستخدم المجهر الضوئي والمجهر الفلوري لتصور هجرة الخلايا غير الملتصقة فوق الطبقة الأحادية.

تظهر النتائج أن هجرة ووظائف المؤثرات للخلايا اللمفاوية T غير الملتصقة في المزارع المشتركة مع طبقة أحادية من الخلايا الورمية الملتصقة تظل محفوظة بعد نقل المتجه الفيروسي القهقري إلى الخلايا اللمفاوية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية قياس الهجرة الشعاعية للخلايا اللمفاوية T المؤثرة غير الملتصقة في المزرعة المشتركة مع الخلايا الورمية الملتصقة. ولهذا تداعيات بعيدة المدى على المرضى الذين يعانون من أورام دماغية أولية أو نقيلية، حيث يجري اختبار الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا الخيفية والمعدلة للتعبير عن جين منشط للدواء الأولي، مثل cytosine deaminase، كنهج متعدد الوسائط للقضاء على الأورام في الدماغ.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في تكوين طبقات أحادية ملتصقة من الخلايا الورمية، وذلك بسبب التباين في خصائص الالتصاق أثناء نمو الخلايا الورمية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث تتطلب خطوات إنشاء طبقة ورمية أحادية متساوية وترسيب فعال لخلايا L-O-C-T-L غير الملتصقة فهماً خبيراً لخصائص كلا النوعين من الخلايا. للبدء، ضع ما يصل إلى أربعة من المعقمات.

شرائح مغطاة بالتيفلون تحتوي على 10 آبار في طبق بتري معقم بمقاس 150 millimeter by 15 millimeter. ضع طبق بتري بمقاس 35 millimeter by 10 millimeter يحتوي على two to three milliliters من الماء المعقم بجانب الشرائح لتوفير الرطوبة. بعد ذلك، قم بطلاء الشرائح مسبقاً عن طريق تغطية كل بئر بمحلول بتركيز 100 micrograms per milliliter من poly D lycine أو poly L lysine.

يتم تحضين الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم سحب المحلول وشطف سطح البئر مرتين باستخدام PBS مع تحضير آبار العينات. يتم حصاد دورق يحتوي على طبقة متلاحمة من الخلايا الورمية الملتصقة. يتم عد عدد الخلايا الحية باستخدام المجهر الضوئي، ثم يتم تعليق الخلايا بتركيز 5 × 10⁶ خلية/ملليلتر.

في وسط نمو مُنظّم، أضف من 5 إلى 10 µL من معلق الخلايا إلى كل بئر، وذلك حسب نوع الخلايا الورمية، ثم أكمل حجم السائل في البئر ليصل إلى 40 µL باستخدام الوسط الغذائي، واستخدم الماصة للسحب والدفع ببطء لتوزيع الخلايا بالتساوي. بعد زراعة الآبار، اترك الخلايا الورمية لتستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، ضع الغطاء على طبق بتري وانقله بعناية إلى حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% carbon dioxide، واتركها للحضانة لمدة 24 ساعة على الأقل.

قم بتغيير وسط الزرع في الآبار يومياً عن طريق إزالة جزء من الوسط بعناية من الطبقة الأحادية واستبداله بحجم أكبر من وسط الخلايا التائية الكامل والطازج. عادة ما تصل الخلايا إلى مرحلة التلاقي في غضون يوم واحد إلى ثلاثة أيام لتجهيز الخلايا للترسيب فوق الطبقة الأحادية للخلايا الورمية. قم بحصد الخلايا التائية غير الملتصقة ووسمها بصبغة تكاثر الخلايا وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء المقايسة.

ضع بعد ذلك الغرفة المرطبة التي تحتوي على شرائح الخلايا الورمية داخل كابينة السلامة البيولوجية. اغسل الآبار باستخدام PBS عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم أضف 45 µL من الوسط الغذائي الكامل الذي يحتوي على 10% مصل إلى الآبار. قم بتمرير مجمع ترسيب الخلايا المعقم فوق الآبار حتى يلامس الخطاف الموجود في نهاية المجمع قاع الشريحة.

تأكد من رؤية الوسط في قنوات المجمّع. بعد ذلك، قم بعد الخلايا غير الملتصقة وعلّقها بتركيز يتراوح من 1 إلى 2 × 10⁵ خلية لكل µL في الوسط.

قم بتفكيك الخلايا بلطف للتخلص من أي تكتلات خلوية قد تعيق ترسيب الخلايا. اسحب ببطء باستخدام الماصة مقدار 1 µL من معلق الخلايا وأضفه إلى قناة الموزع لكل بئر، ثم قم بتحضين الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة للسماح للخلايا الموجودة في القناة بالاستقرار على الطبقة الأحادية.

بعد استقرار الخلايا، ارفع الموزع (manifold) برفق وبشكل رأسي دون لمس الشريحة. تأكد من استقرار كتل الخلايا ضمن محيط قناة الموزع. عند الفحص بالمجهر، يجب أن تلتصق الخلايا المستقرة قليلاً بالطبقة الأحادية بحيث لا يؤدي تحريك الشريحة برفق إلى تشتت الكتلة.

بعد التأكد من ترسب الخلايا، انقل الشريحة إلى مجهر مقلوب مجهز بغرفة رطوبة وثاني أكسيد الكربون. استخدم الشيئية 4x للتصوير الميداني المضيء والتصوير الفلوري متعدد القنوات للخلايا. التقط صوراً لمنطقة محددة في القنوات الميدانية المضيئة والفلورية، ثم أضف مقاييس الميكرون باستخدام برنامج التقاط الصور.

قم بتخزين الشريحة في حاضنة رطبة بين النقاط الزمنية بمجرد الحصول على جميع النقاط الزمنية. اسحب ملفات الصور وأفلتها في برنامج تحرير الصور واختر خيار "إضافة طبقة" لإنشاء ملف صورة يحتوي على طبقات متعددة. قم بدمج الصور الضوئية والصور الفلورية في طبقة واحدة.

استخدم برنامج الحصول على الصور لالتقاط صور لمنطقة بمساحة 8 mm × 8 mm. يجب ضبط البرنامج لدمج الصور الملتقطة تلقائياً باستخدام القناة الأكثر تمثيلاً عبر البئر بأكمله. وفي حال تصوير القنوات الفلورية فقط، يجب أن تكون هذه هي القناة المخصصة لتصوير الخلايا الملتصقة.

وبدلاً من ذلك، يمكن دمج الصور باستخدام برنامج لتحرير الصور. يتم ذلك من خلال محاذاة المناطق المتطابقة في الصور من صورة إلى أخرى، ثم تراكب الصور فوق بعضها البعض حتى يتم الحصول على صورة كاملة. قم بدمج الصور معاً باستخدام برنامج الصور.

استخدم الصور المدمجة لإنشاء خرائط شدة الفلورة السطحية باستخدام برنامج Image J لتصور تجميع الخلايا التائية الفلورية أو انتشارها بمرور الوقت. تم وضع الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا ذات التفاعل الخيفي البشرية، والمعروفة باسم Allo CTL، والتي تم نقلها بواسطة ناقل ريتروفيروسي قادر على التضاعف يشفر جيناً للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر الزمردي، في مركز طبقة أحادية من خلايا الورم الدبقي. وبعد مرور أربع ساعات، كانت خلايا Allo CTL قد شكلت تجمعات مرئية بحلول الساعة 24.

ظهرت بقع فارغة في الطبقة الأحادية من الخلايا الملتصقة، مما يشير إلى تحلل الخلايا الورمية، كما هاجرت بعض الخلايا التائية السامة للخلايا الخيفية (allo CTL) إلى ما وراء الحافة الأمامية. وُضعت خلايا Allo CTL فئرانية مُعلمة فلورياً في مركز طبقة أحادية من خلايا الورم الدبقي المُعلمة فلورياً؛ فبعد مرور ساعة واحدة، ارتبطت خلايا Allo CTL ارتباطاً وثيقاً بخلايا الورم الدبقي، وبحلول 48 ساعة، هاجرت خلايا Allo CTL بعيداً عن مركز سطح الطبقة الأحادية. أُنشئت خرائط الفلورة من هذه الصور باستخدام برنامج Image J، وهي تظهر هجرة ملحوظة بعيداً عن المركز بعد 48 ساعة.

من المهم تغيير وسط الزرع يومياً لطبقة الخلايا الورمية أحادية الطبقة للحفاظ على ظروف زرع صحية. بالإضافة إلى ذلك، وبمجرد إتقان العملية، يجب أن يستغرق ترسيب الخلايا غير الملتصقة حوالي 20 دقيقة باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل تتبع مسار الخلايا للإجابة على تساؤلات حول المعدل الذي تهاجر به خلايا allo CTL عبر الطبقة أحادية الطبقة، أو الوقت الذي تقضيه في الاتصال بالخلايا الورمية أثناء أداء وظائفها السامة للخلايا.

سيساعد هذا البروتوكول الباحثين في مجال العلاج الجيني المناعي على استكشاف هجرة الخلايا اللمفاوية T المعدلة جينياً في المزارع المشتركة مع الخلايا الورمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا غير الملتصقة والخلايا الملتصقة من أجل المزرعة المشتركة، وكيفية استخدام مجمع ترسيب الخلايا لدراسة الهجرة الشعاعية الأفقية للخلايا غير الملتصقة فوق طبقة أحادية من الخلايا الورمية.